| 摘要 | 第3-7页 |
| ABSTRACT | 第7-11页 |
| 第一章 绪论 | 第17-27页 |
| 1.1 ALDH2研究概述 | 第17-20页 |
| 1.1.1 ALDH2来源与分类 | 第17页 |
| 1.1.2 ALDH2的基因多态性 | 第17-18页 |
| 1.1.3 ALDH2的基因多态性分布 | 第18页 |
| 1.1.4 ALDH2的催化机理 | 第18-19页 |
| 1.1.5 ALDH2的基因多态性在医学领域的研究 | 第19-20页 |
| 1.1.5.1 ALDH2的基因多态性与肝癌之间的关系 | 第20页 |
| 1.1.5.2 ALDH2的基因多态性对高血压的影响 | 第20页 |
| 1.2 大肠杆菌原核表达系统 | 第20-23页 |
| 1.2.1 大肠杆菌表达系统的组成 | 第21-22页 |
| 1.2.1.1 大肠杆菌表达载体 | 第21页 |
| 1.2.1.2 外源基因结构 | 第21-22页 |
| 1.2.1.3 表达宿主 | 第22页 |
| 1.2.2 大肠杆菌表达系统分类 | 第22-23页 |
| 1.3 密码子优化 | 第23-24页 |
| 1.3.1 密码子优化主要策略 | 第23-24页 |
| 1.3.2 密码子协调化 | 第24页 |
| 1.4 解酒药物的研究进展 | 第24-26页 |
| 1.5 本课题的研究目的和意义 | 第26-27页 |
| 第二章 人乙醛脱氢酶2的分子克隆 | 第27-43页 |
| 2.1 前言 | 第27页 |
| 2.2 实验材料和方法 | 第27-37页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第27页 |
| 2.2.2 实验试剂 | 第27-28页 |
| 2.2.3 试剂制备 | 第28页 |
| 2.2.4 主要仪器和设备 | 第28-29页 |
| 2.2.5 菌种活化 | 第29页 |
| 2.2.6 引物的设计与合成 | 第29页 |
| 2.2.7 HepG2肝癌细胞总RNA的提取 | 第29-30页 |
| 2.2.8 RT-PCR获取cDNA | 第30页 |
| 2.2.9 ALDH2基因PCR扩增 | 第30-31页 |
| 2.2.10 PCR产物的回收及纯化 | 第31-32页 |
| 2.2.11 克隆质粒pMD19-T-ALDH2的构建 | 第32页 |
| 2.2.12 转化 | 第32-34页 |
| 2.2.12.1 制备E.coli DH5α感受态细胞 | 第32-33页 |
| 2.2.12.2 转化 | 第33-34页 |
| 2.2.13 阳性质粒抽提 | 第34-35页 |
| 2.2.14 重组表达载体pET44b-ALDH2的构建 | 第35-37页 |
| 2.2.14.1 pMD19-T-ALDH2和pET44b(+)质粒获取 | 第35页 |
| 2.2.14.2 ALDH2基因片段和pET44b(+)线性化质粒的获取 | 第35-36页 |
| 2.2.14.3 双酶切片段的回收纯化 | 第36页 |
| 2.2.14.4 重组表达质粒pET44b-ALDH2的构建 | 第36页 |
| 2.2.14.5 重组表达质粒pET44b -ALDH2的转化及鉴定 | 第36-37页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第37-42页 |
| 2.3.1 PCR扩增获得目的基因结果 | 第37-38页 |
| 2.3.2 pMD19-T-ALDH2测序及序列比对分析 | 第38-39页 |
| 2.3.3 阳性克隆质粒pMD19-T-ALDH2的构建及酶切鉴定 | 第39-40页 |
| 2.3.4 重组表达质粒pET44b-ALDH2的构建及鉴定 | 第40-42页 |
| 2.3.4.1 重组表达质粒pET44b-ALDH2的构建 | 第40-41页 |
| 2.3.4.2 pET44b-ALDH2酶切鉴定 | 第41-42页 |
| 2.4 本章小结 | 第42-43页 |
| 第三章 人乙醛脱氢酶2的密码子优化 | 第43-54页 |
| 3.1 前言 | 第43页 |
| 3.2 实验材料和方法 | 第43-46页 |
| 3.2.1 实验试剂 | 第43页 |
| 3.2.2 主要仪器和设备 | 第43-44页 |
| 3.2.3 密码子优化 | 第44页 |
| 3.2.4 pET44b-ALDH2-OP表达载体的构建 | 第44-46页 |
| 3.2.4.1 ALDH2-OP基因和pET44b(+)质粒酶切片段的获取 | 第44-45页 |
| 3.2.4.2 原核表达载体pET44b-ALDH2-OP的构建 | 第45页 |
| 3.2.4.3 重组质粒pET44b -ALDH2-OP的转化及鉴定 | 第45-46页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第46-53页 |
| 3.3.1 人乙醛脱氢酶的基因合成分析 | 第46-49页 |
| 3.3.2 ALDH2-OP基因的密码子优化分析 | 第49-52页 |
| 3.3.2.1 密码子适应指数(CAI)分析 | 第49页 |
| 3.3.2.2 GC含量分析 | 第49-50页 |
| 3.3.2.3 优化前后密码子使用情况分析 | 第50-52页 |
| 3.3.3 重组表达质粒pET44b-ALDH2-OP的构建及酶切鉴定 | 第52-53页 |
| 3.4 本章小结 | 第53-54页 |
| 第四章 重组蛋白ALDH2和ALDH2-OP的表达及其条件优化 | 第54-68页 |
| 4.1 前言 | 第54页 |
| 4.2 实验材料和方法 | 第54-59页 |
| 4.2.1 主要试剂 | 第54页 |
| 4.2.2 仪器设备 | 第54-55页 |
| 4.2.3 主要溶液配制 | 第55-56页 |
| 4.2.4 重组蛋白诱导表达 | 第56页 |
| 4.2.5 SDS-PAGE | 第56-57页 |
| 4.2.6 重组蛋白表达条件优化 | 第57-58页 |
| 4.2.6.1 IPTG浓度 | 第57页 |
| 4.2.6.2 诱导时间优化 | 第57页 |
| 4.2.6.3 诱导温度优化 | 第57页 |
| 4.2.6.4 低温诱导对蛋白表达的影响 | 第57-58页 |
| 4.2.7 IOD分析 | 第58页 |
| 4.2.8 重组蛋白鉴定 | 第58-59页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第59-67页 |
| 4.3.1 ALDH2蛋白表达条件优化 | 第59-62页 |
| 4.3.1.1 IPTG浓度 | 第59-60页 |
| 4.3.1.2 诱导时间优化 | 第60-61页 |
| 4.3.1.3 诱导温度优化 | 第61页 |
| 4.3.1.4 低温诱导对蛋白表达的影响 | 第61-62页 |
| 4.3.2 ALDH2-OP蛋白表达条件优化 | 第62-65页 |
| 4.3.2.1 IPTG浓度 | 第62-63页 |
| 4.3.2.2 诱导时间优化 | 第63-64页 |
| 4.3.2.3 诱导温度优化 | 第64页 |
| 4.3.2.4 低温诱导对蛋白表达的影响 | 第64-65页 |
| 4.3.3 ALDH2和ALDH2-OP蛋白表达分析 | 第65-66页 |
| 4.3.4 重组蛋白表达产物鉴定 | 第66-67页 |
| 4.4 本章小结 | 第67-68页 |
| 第五章 重组蛋白ALDH2和ALDH2-OP的复性和纯化 | 第68-76页 |
| 5.1 前言 | 第68页 |
| 5.2 实验材料和方法 | 第68-72页 |
| 5.2.1 实验材料 | 第68页 |
| 5.2.2 仪器与设备 | 第68-69页 |
| 5.2.3 主要溶液配制 | 第69页 |
| 5.2.4 重组蛋白ALDH2和ALDH2-OP大量制备 | 第69-70页 |
| 5.2.5 重组菌包涵体蛋白ALDH2和ALDH2-OP的分离纯化及复性 | 第70-71页 |
| 5.2.5.1 包涵体的洗涤和溶解 | 第70页 |
| 5.2.5.2 Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白ALDH2和ALDH2-OP | 第70-71页 |
| 5.2.5.3 优化层析纯化条件 | 第71页 |
| 5.2.5.4 纯化后的蛋白ALDH2及ALDH2-OP复性 | 第71页 |
| 5.2.6 蛋白浓度测定 | 第71-72页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第72-75页 |
| 5.3.1 ALDH2亲和层析洗脱条件优化 | 第72-73页 |
| 5.3.2 ALDH2-OP亲和层析洗脱条件优化 | 第73-74页 |
| 5.3.3 ALDH2和ALDH2-OP的复性和浓度测定 | 第74-75页 |
| 5.4 本章小结 | 第75-76页 |
| 第六章 人乙醛脱氢酶2的酶活及稳定性研究 | 第76-85页 |
| 6.1 前言 | 第76页 |
| 6.2 实验材料和方法 | 第76-79页 |
| 6.2.1 实验材料 | 第76页 |
| 6.2.2 主要仪器 | 第76页 |
| 6.2.3 人乙醛脱氢酶2最适反应温度及pH测定 | 第76-77页 |
| 6.2.4 人乙醛脱氢酶2酶活性分析 | 第77-78页 |
| 6.2.5 人乙醛脱氢酶2热稳定性及酸碱稳定性分析 | 第78页 |
| 6.2.6 金属离子对人乙醛脱氢酶2活性的影响 | 第78页 |
| 6.2.7 乙醛脱氢酶2动力学研究 | 第78-79页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第79-83页 |
| 6.3.1 人乙醛脱氢酶2最适反应温度及最适反应pH分析 | 第79-80页 |
| 6.3.1.1 最适反应温度分析 | 第79页 |
| 6.3.1.2 最适反应pH分析 | 第79-80页 |
| 6.3.2 酶活性分析 | 第80-81页 |
| 6.3.3 人乙醛脱氢酶2热稳定性及酸碱稳定性分析 | 第81-82页 |
| 6.3.3.1 热稳定性分析 | 第81页 |
| 6.3.3.2 酸碱稳定性分析 | 第81-82页 |
| 6.3.4 金属离子对人乙醛脱氢酶2活性的影响 | 第82-83页 |
| 6.3.5 乙醛脱氢酶2动力学研究 | 第83页 |
| 6.4 本章小结 | 第83-85页 |
| 第七章 总结与展望 | 第85-87页 |
| 参考文献 | 第87-96页 |
| 致谢 | 第96-97页 |
