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人乙醛脱氢酶2的密码子优化及分子克隆

摘要第3-7页
ABSTRACT第7-11页
第一章 绪论第17-27页
    1.1 ALDH2研究概述第17-20页
        1.1.1 ALDH2来源与分类第17页
        1.1.2 ALDH2的基因多态性第17-18页
        1.1.3 ALDH2的基因多态性分布第18页
        1.1.4 ALDH2的催化机理第18-19页
        1.1.5 ALDH2的基因多态性在医学领域的研究第19-20页
            1.1.5.1 ALDH2的基因多态性与肝癌之间的关系第20页
            1.1.5.2 ALDH2的基因多态性对高血压的影响第20页
    1.2 大肠杆菌原核表达系统第20-23页
        1.2.1 大肠杆菌表达系统的组成第21-22页
            1.2.1.1 大肠杆菌表达载体第21页
            1.2.1.2 外源基因结构第21-22页
            1.2.1.3 表达宿主第22页
        1.2.2 大肠杆菌表达系统分类第22-23页
    1.3 密码子优化第23-24页
        1.3.1 密码子优化主要策略第23-24页
        1.3.2 密码子协调化第24页
    1.4 解酒药物的研究进展第24-26页
    1.5 本课题的研究目的和意义第26-27页
第二章 人乙醛脱氢酶2的分子克隆第27-43页
    2.1 前言第27页
    2.2 实验材料和方法第27-37页
        2.2.1 菌株和质粒第27页
        2.2.2 实验试剂第27-28页
        2.2.3 试剂制备第28页
        2.2.4 主要仪器和设备第28-29页
        2.2.5 菌种活化第29页
        2.2.6 引物的设计与合成第29页
        2.2.7 HepG2肝癌细胞总RNA的提取第29-30页
        2.2.8 RT-PCR获取cDNA第30页
        2.2.9 ALDH2基因PCR扩增第30-31页
        2.2.10 PCR产物的回收及纯化第31-32页
        2.2.11 克隆质粒pMD19-T-ALDH2的构建第32页
        2.2.12 转化第32-34页
            2.2.12.1 制备E.coli DH5α感受态细胞第32-33页
            2.2.12.2 转化第33-34页
        2.2.13 阳性质粒抽提第34-35页
        2.2.14 重组表达载体pET44b-ALDH2的构建第35-37页
            2.2.14.1 pMD19-T-ALDH2和pET44b(+)质粒获取第35页
            2.2.14.2 ALDH2基因片段和pET44b(+)线性化质粒的获取第35-36页
            2.2.14.3 双酶切片段的回收纯化第36页
            2.2.14.4 重组表达质粒pET44b-ALDH2的构建第36页
            2.2.14.5 重组表达质粒pET44b -ALDH2的转化及鉴定第36-37页
    2.3 结果与讨论第37-42页
        2.3.1 PCR扩增获得目的基因结果第37-38页
        2.3.2 pMD19-T-ALDH2测序及序列比对分析第38-39页
        2.3.3 阳性克隆质粒pMD19-T-ALDH2的构建及酶切鉴定第39-40页
        2.3.4 重组表达质粒pET44b-ALDH2的构建及鉴定第40-42页
            2.3.4.1 重组表达质粒pET44b-ALDH2的构建第40-41页
            2.3.4.2 pET44b-ALDH2酶切鉴定第41-42页
    2.4 本章小结第42-43页
第三章 人乙醛脱氢酶2的密码子优化第43-54页
    3.1 前言第43页
    3.2 实验材料和方法第43-46页
        3.2.1 实验试剂第43页
        3.2.2 主要仪器和设备第43-44页
        3.2.3 密码子优化第44页
        3.2.4 pET44b-ALDH2-OP表达载体的构建第44-46页
            3.2.4.1 ALDH2-OP基因和pET44b(+)质粒酶切片段的获取第44-45页
            3.2.4.2 原核表达载体pET44b-ALDH2-OP的构建第45页
            3.2.4.3 重组质粒pET44b -ALDH2-OP的转化及鉴定第45-46页
    3.3 结果与讨论第46-53页
        3.3.1 人乙醛脱氢酶的基因合成分析第46-49页
        3.3.2 ALDH2-OP基因的密码子优化分析第49-52页
            3.3.2.1 密码子适应指数(CAI)分析第49页
            3.3.2.2 GC含量分析第49-50页
            3.3.2.3 优化前后密码子使用情况分析第50-52页
        3.3.3 重组表达质粒pET44b-ALDH2-OP的构建及酶切鉴定第52-53页
    3.4 本章小结第53-54页
第四章 重组蛋白ALDH2和ALDH2-OP的表达及其条件优化第54-68页
    4.1 前言第54页
    4.2 实验材料和方法第54-59页
        4.2.1 主要试剂第54页
        4.2.2 仪器设备第54-55页
        4.2.3 主要溶液配制第55-56页
        4.2.4 重组蛋白诱导表达第56页
        4.2.5 SDS-PAGE第56-57页
        4.2.6 重组蛋白表达条件优化第57-58页
            4.2.6.1 IPTG浓度第57页
            4.2.6.2 诱导时间优化第57页
            4.2.6.3 诱导温度优化第57页
            4.2.6.4 低温诱导对蛋白表达的影响第57-58页
        4.2.7 IOD分析第58页
        4.2.8 重组蛋白鉴定第58-59页
    4.3 结果与讨论第59-67页
        4.3.1 ALDH2蛋白表达条件优化第59-62页
            4.3.1.1 IPTG浓度第59-60页
            4.3.1.2 诱导时间优化第60-61页
            4.3.1.3 诱导温度优化第61页
            4.3.1.4 低温诱导对蛋白表达的影响第61-62页
        4.3.2 ALDH2-OP蛋白表达条件优化第62-65页
            4.3.2.1 IPTG浓度第62-63页
            4.3.2.2 诱导时间优化第63-64页
            4.3.2.3 诱导温度优化第64页
            4.3.2.4 低温诱导对蛋白表达的影响第64-65页
        4.3.3 ALDH2和ALDH2-OP蛋白表达分析第65-66页
        4.3.4 重组蛋白表达产物鉴定第66-67页
    4.4 本章小结第67-68页
第五章 重组蛋白ALDH2和ALDH2-OP的复性和纯化第68-76页
    5.1 前言第68页
    5.2 实验材料和方法第68-72页
        5.2.1 实验材料第68页
        5.2.2 仪器与设备第68-69页
        5.2.3 主要溶液配制第69页
        5.2.4 重组蛋白ALDH2和ALDH2-OP大量制备第69-70页
        5.2.5 重组菌包涵体蛋白ALDH2和ALDH2-OP的分离纯化及复性第70-71页
            5.2.5.1 包涵体的洗涤和溶解第70页
            5.2.5.2 Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白ALDH2和ALDH2-OP第70-71页
            5.2.5.3 优化层析纯化条件第71页
            5.2.5.4 纯化后的蛋白ALDH2及ALDH2-OP复性第71页
        5.2.6 蛋白浓度测定第71-72页
    5.3 结果与讨论第72-75页
        5.3.1 ALDH2亲和层析洗脱条件优化第72-73页
        5.3.2 ALDH2-OP亲和层析洗脱条件优化第73-74页
        5.3.3 ALDH2和ALDH2-OP的复性和浓度测定第74-75页
    5.4 本章小结第75-76页
第六章 人乙醛脱氢酶2的酶活及稳定性研究第76-85页
    6.1 前言第76页
    6.2 实验材料和方法第76-79页
        6.2.1 实验材料第76页
        6.2.2 主要仪器第76页
        6.2.3 人乙醛脱氢酶2最适反应温度及pH测定第76-77页
        6.2.4 人乙醛脱氢酶2酶活性分析第77-78页
        6.2.5 人乙醛脱氢酶2热稳定性及酸碱稳定性分析第78页
        6.2.6 金属离子对人乙醛脱氢酶2活性的影响第78页
        6.2.7 乙醛脱氢酶2动力学研究第78-79页
    6.3 结果与讨论第79-83页
        6.3.1 人乙醛脱氢酶2最适反应温度及最适反应pH分析第79-80页
            6.3.1.1 最适反应温度分析第79页
            6.3.1.2 最适反应pH分析第79-80页
        6.3.2 酶活性分析第80-81页
        6.3.3 人乙醛脱氢酶2热稳定性及酸碱稳定性分析第81-82页
            6.3.3.1 热稳定性分析第81页
            6.3.3.2 酸碱稳定性分析第81-82页
        6.3.4 金属离子对人乙醛脱氢酶2活性的影响第82-83页
        6.3.5 乙醛脱氢酶2动力学研究第83页
    6.4 本章小结第83-85页
第七章 总结与展望第85-87页
参考文献第87-96页
致谢第96-97页

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