| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 绪论 | 第9-21页 |
| 1.1 手性化合物 | 第9-11页 |
| 1.1.1 手性的概念 | 第9页 |
| 1.1.2 手性药物 | 第9页 |
| 1.1.3 手性仲醇的作用及合成方法 | 第9-10页 |
| 1.1.4 (R/S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇[(R/S)-CPMA]的研究进展 | 第10-11页 |
| 1.2 醇脱氢酶的简介 | 第11-14页 |
| 1.2.1 醇脱氢酶 | 第11-12页 |
| 1.2.2 短链醇脱氢酶的一般结构性质 | 第12页 |
| 1.2.3 短链醇脱氢酶的催化机制 | 第12-13页 |
| 1.2.4 醇脱氢酶不对称还原反应的立体选择性 | 第13-14页 |
| 1.3 醇脱氢酶的分子改造 | 第14-16页 |
| 1.3.1 定向进化 | 第14-15页 |
| 1.3.2 理性设计 | 第15页 |
| 1.3.3 半理性设计 | 第15-16页 |
| 1.4 蛋白质的结晶及结构解析 | 第16-18页 |
| 1.4.1 X射线衍射的原理 | 第16-17页 |
| 1.4.2 蛋白质的结晶过程及方法 | 第17-18页 |
| 1.4.3 相位的确定 | 第18页 |
| 1.5 本论文的研究意义和主要研究内容 | 第18-21页 |
| 1.5.1 课题来源 | 第18页 |
| 1.5.2 本课题的研究意义与研究背景 | 第18-19页 |
| 1.5.3 本论文的主要研究内容 | 第19-21页 |
| 第二章 材料与方法 | 第21-35页 |
| 2.1 实验材料 | 第21-23页 |
| 2.1.1 实验试剂及来源 | 第21-22页 |
| 2.1.2 实验器材及来源 | 第22页 |
| 2.1.3 实验所用引物 | 第22-23页 |
| 2.1.4 主要培养基 | 第23页 |
| 2.2 分析方法 | 第23-25页 |
| 2.2.1 酶活力的测定方法 | 第23页 |
| 2.2.2 蛋白含量测定 | 第23-24页 |
| 2.2.3 SDS-PAGE电泳分析 | 第24页 |
| 2.2.4 液相色谱(HPLC)检测法 | 第24页 |
| 2.2.5 气相色谱(GC)检测法 | 第24-25页 |
| 2.3 实验方法 | 第25-35页 |
| 2.3.1 HCSM饱和突变库的构建 | 第25-26页 |
| 2.3.2 定点突变菌株的构建 | 第26页 |
| 2.3.3 组合突变文库的构建 | 第26-27页 |
| 2.3.4 通量筛选方法 | 第27页 |
| 2.3.5 目的蛋白的过表达 | 第27-28页 |
| 2.3.6 KpADH蛋白纯化 | 第28页 |
| 2.3.7 KpADH突变体动力学参数测定 | 第28-29页 |
| 2.3.8 底物谱分析 | 第29-30页 |
| 2.3.9 冻干酶粉制备(R)-CPMA | 第30-31页 |
| 2.3.10 KpADHC端His-Tag切除 | 第31页 |
| 2.3.11 KpADH结晶蛋白的制备与纯化 | 第31-32页 |
| 2.3.12 KpADH晶体筛选与优化 | 第32-33页 |
| 2.3.13 KpADH晶体数据收集 | 第33页 |
| 2.3.14 KpADH晶体数据处理及解析 | 第33页 |
| 2.3.15 蛋白结构与底物分子对接 | 第33-35页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第35-63页 |
| 3.1 HCSM策略提高醇脱氢酶KpADH的对映选择性 | 第35-42页 |
| 3.1.1 HCSM文库的建立 | 第35-36页 |
| 3.1.2 HCSM文库的筛选 | 第36-37页 |
| 3.1.3 KpADH突变体纯化 | 第37-38页 |
| 3.1.4 动力学分析 | 第38-39页 |
| 3.1.5 底物谱分析 | 第39-40页 |
| 3.1.6 突变体50C10冻干酶粉制备(R)-CPMA | 第40-42页 |
| 3.2 Glu214和Ser237位点研究 | 第42-51页 |
| 3.2.1 KpADH单点突变体的构建 | 第42页 |
| 3.2.2 KpADH单点突变体催化性质和立体选择性分析 | 第42-45页 |
| 3.2.3 KpADH单点突变体动力学参数 | 第45-47页 |
| 3.2.4 KpADH214和237位点组合突变文库的建立 | 第47页 |
| 3.2.5 KpADH214和237位点组合突变文库的筛选 | 第47-48页 |
| 3.2.6 KpADH最优双突变体的表征 | 第48-49页 |
| 3.2.7 KpADH最优双突变体的底物特异性 | 第49-50页 |
| 3.2.8 KpADH最优突变体对不同底物选择性比较 | 第50-51页 |
| 3.3 KpADH蛋白结晶及结构解析 | 第51-57页 |
| 3.3.1 KpADHC端His-Tag切除 | 第51-52页 |
| 3.3.2 KpADH结晶蛋白制备 | 第52-53页 |
| 3.3.3 KpADH蛋白结晶初筛 | 第53-55页 |
| 3.3.4 KpADH蛋白结晶优化 | 第55页 |
| 3.3.5 KpADH晶体衍射数据收集 | 第55-56页 |
| 3.3.6 KpADH晶体结构解析 | 第56-57页 |
| 3.4 KpADH的晶体结构分析 | 第57-63页 |
| 3.4.1 KpADH的整体结构 | 第57页 |
| 3.4.2 KpADH的结构比较 | 第57-59页 |
| 3.4.3 KpADH的辅酶结合中心 | 第59-60页 |
| 3.4.4 KpADH的催化中心 | 第60-61页 |
| 3.4.5 分子模型解释手性识别机制 | 第61-63页 |
| 主要结论与展望 | 第63-65页 |
| 主要结论 | 第63-64页 |
| 工作展望 | 第64-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-71页 |
| 附录1：HCSM建库引用的引物 | 第71-72页 |
| 附录2：定点突变引用的引物 | 第72-73页 |
| 附录3：最优突变体组合突变引物和混合质粒 | 第73-74页 |
| 附录4：KpADH突变体蛋白纯化SDS-PAGE分析图 | 第74-75页 |
| 附录5：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第75页 |
