| 摘要 | 第11-12页 |
| ABSTRACT | 第12-13页 |
| 缩略语一览表 | 第14-16页 |
| 第一部分 前言 | 第16-31页 |
| 1 弧菌病危害及流行特征 | 第16-20页 |
| 1.1 弧菌病及感染传播途径 | 第16-18页 |
| 1.2 弧菌形态、分类 | 第18页 |
| 1.3 弧菌的致病机理 | 第18-19页 |
| 1.4 弧菌病的治疗 | 第19-20页 |
| 2. 高通量药物筛选技术概述 | 第20-27页 |
| 2.1 细胞水平药物筛选模型 | 第21-22页 |
| 2.2 分子水平筛选模型 | 第22-27页 |
| 2.2.1 萜类及生物合成途径概述 | 第22-27页 |
| 3 海洋真菌 | 第27-30页 |
| 4. 本论文立题依据及研究意义 | 第30-31页 |
| 第二部分 材料与方法 | 第31-51页 |
| 1 实验材料 | 第31-36页 |
| 1.1 培养基 | 第31-32页 |
| 1.2 相关溶液的配制 | 第32-33页 |
| 1.3 工具酶 | 第33页 |
| 1.4 试剂盒 | 第33页 |
| 1.5 相关试剂与药品 | 第33-34页 |
| 1.6 主要仪器与设备 | 第34页 |
| 1.7 供试海洋真菌及病原菌、质粒及菌种 | 第34-36页 |
| 2 刃天青高通量筛选抗弧菌活性化合物方法的建立 | 第36-39页 |
| 2.1 弧菌的培养 | 第36页 |
| 2.2 刃天青筛选方法最适条件的确定 | 第36页 |
| 2.3 环丙沙星及红霉素抗弧菌的最低抑菌浓度的测定 | 第36-37页 |
| 2.3.1 刃天青法 | 第36-37页 |
| 2.3.2 平板稀释法 | 第37页 |
| 2.4 刃天青作为显示剂高通量检测海洋真菌天然馏分抗弧菌活性 | 第37-39页 |
| 2.4.1 海洋真菌初级馏分库的建立 | 第37-38页 |
| 2.4.2 高通量筛选抗弧菌的活性馏分 | 第38页 |
| 2.4.3 高通量筛选技术参数评价 | 第38页 |
| 2.4.4 海洋真菌天然次级馏分的制备 | 第38-39页 |
| 2.4.5 次级馏分的筛选及单一化合物MIC及MBC的测定 | 第39页 |
| 3 以Dxr为靶点的新型抗弧菌药物分子水平模型的建立和应用 | 第39-51页 |
| 3.1 DNA相关实验和方法 | 第39-45页 |
| 3.1.1 创伤弧菌E1758总基因组的提取E1758 | 第39-40页 |
| 3.1.2 大肠杆菌感受态的制备 | 第40页 |
| 3.1.3 转化 | 第40-41页 |
| 3.1.4 小量质粒DNA的提取 | 第41页 |
| 3.1.5 脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶基因克隆及测序 | 第41-45页 |
| 3.2 His-DXR融合蛋白诱导表达及纯化 | 第45-48页 |
| 3.2.1 His-DXR融合蛋白的原核表达 | 第45页 |
| 3.2.2 采用Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白 | 第45-46页 |
| 3.2.3 SDS-PAGE | 第46-47页 |
| 3.2.4 测定蛋白浓度 | 第47页 |
| 3.2.5 Ni-NTA再生和制备 | 第47-48页 |
| 3.3 抑制His-DXR酶活性次级馏分的筛选 | 第48-51页 |
| 3.3.1 还原型辅酶ⅡOD值-浓度线性标准曲线的制作 | 第48-49页 |
| 3.3.2 1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶(His-DXR)的活性测定 | 第49页 |
| 3.3.3 筛选模型的初步建立 | 第49-51页 |
| 第三部分 实验结果与分析 | 第51-69页 |
| 1 刃天青高通量筛选抗弧菌活性化合物方法的建立 | 第51-61页 |
| 1.1 刃天青高通量筛选最适条件的确定 | 第51-52页 |
| 1.2 环丙沙星及红霉素抗弧菌的最低抑菌浓度的测定 | 第52-56页 |
| 1.3 刃天青作为显示剂高通量检测海洋真菌天然馏分抗弧菌活性 | 第56-59页 |
| 1.4 次级馏分的筛选及单一化合物MIC及MBC的测定 | 第59-61页 |
| 2 以Dxr为靶点的新型抗弧菌药物分子水平模型的建立 | 第61-69页 |
| 2.1 pET-22b~+-dxr表达载体的构建和鉴定 | 第61页 |
| 2.2 His-DXR融合蛋白的诱导表达及纯化 | 第61页 |
| 2.3 His-DXR蛋白浓度的测定 | 第61-63页 |
| 2.4 还原型辅酶ⅡOD值-浓度线性标准曲线的制作 | 第63页 |
| 2.5 重组His-DXR的酶活性的测定及NADPH稳定性考察 | 第63-64页 |
| 2.6 最适酶活反应条件的测定 | 第64-69页 |
| 2.6.1 缓冲溶液浓度的确定 | 第64页 |
| 2.6.2 体系反应温度的确定 | 第64-65页 |
| 2.6.3 反应体系pH的确定 | 第65-66页 |
| 2.6.4 Mg~(2+)加入浓度的确定 | 第66页 |
| 2.6.5 反应体系中DXP加入量的确定 | 第66-67页 |
| 2.6.6 标准品膦胺霉素及海洋真菌次级馏分酶活抑制实验 | 第67-69页 |
| 第四部分 讨论 | 第69-73页 |
| 1 刃天青高通量筛选抗弧菌活性化合物方法的建立 | 第69-71页 |
| 2 以Dxr为靶点的新型抗弧菌药物分子水平模型的建立 | 第71-72页 |
| 3 本论文的创新之处 | 第72-73页 |
| 第五部分 结论 | 第73-75页 |
| 参考文献 | 第75-83页 |
| 致谢 | 第83页 |
