| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 目录 | 第7-11页 |
| Contents | 第11-15页 |
| 缩写字母索引 | 第15-16页 |
| 第一章 绪论 | 第16-31页 |
| 1.1 血栓性疾病的现状概述 | 第16页 |
| 1.2 血栓形成机制 | 第16-17页 |
| 1.2.1 机体凝血系统和抗凝血系统 | 第16-17页 |
| 1.2.2 血栓形成 | 第17页 |
| 1.3 纤溶系统及溶栓机理 | 第17-18页 |
| 1.4 溶栓药物的现状及展望 | 第18-20页 |
| 1.4.1 第一代溶栓药物 | 第18页 |
| 1.4.2 第二代溶栓药物 | 第18-19页 |
| 1.4.3 第三代溶栓药物 | 第19页 |
| 1.4.4 展望 | 第19-20页 |
| 1.5 黄粉虫抗血栓实验的研究进展 | 第20页 |
| 1.6 毕赤酵母表达系统 | 第20-28页 |
| 1.6.1 概述 | 第20-21页 |
| 1.6.2 毕赤酵母表达系统的优点 | 第21页 |
| 1.6.3 毕赤酵母表达宿主菌 | 第21-22页 |
| 1.6.4 毕赤酵母表达载体 | 第22-23页 |
| 1.6.5 外源基因在毕赤酵母中的表达步骤 | 第23页 |
| 1.6.6 毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式 | 第23-26页 |
| 1.6.7 影响毕赤酵母表达外源蛋白的因素 | 第26-28页 |
| 1.6.8 毕赤酵母表达系统存在的问题和应用前景 | 第28页 |
| 1.7 本研究的课题来源、主要内容、目的意义及创新性 | 第28-31页 |
| 1.7.1 课题来源 | 第28页 |
| 1.7.2 主要内容 | 第28-29页 |
| 1.7.3 目的意义 | 第29-30页 |
| 1.7.4 创新性 | 第30-31页 |
| 第二章 毕赤酵母表达载体的构建 | 第31-45页 |
| 2.1 实验准备 | 第31-33页 |
| 2.1.1 材料 | 第31-32页 |
| 2.1.2 试剂以及试剂盒 | 第32页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第32-33页 |
| 2.2 试验方法 | 第33-38页 |
| 2.2.1 引物的设计 | 第33页 |
| 2.2.2 质粒的提取 | 第33-34页 |
| 2.2.3 PCR扩增目的基因 | 第34-35页 |
| 2.2.4 目的基因片段的回收 | 第35-36页 |
| 2.2.5 目的片段与T载体的连接反应 | 第36页 |
| 2.2.6 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备(CaCl_2法) | 第36-37页 |
| 2.2.7 细胞的转化 | 第37页 |
| 2.2.8 PCR筛选 | 第37页 |
| 2.2.9 质粒提取及双酶切鉴定 | 第37-38页 |
| 2.3 测序及序列分析 | 第38页 |
| 2.4 表达载体的构建及鉴定 | 第38-39页 |
| 2.4.1 质粒的双酶切体系 | 第38-39页 |
| 2.4.2 pPIC9K质粒的双酶切 | 第39页 |
| 2.4.3 双酶切后的质粒载体与目的片段的连接与转化 | 第39页 |
| 2.5 结果与分析 | 第39-43页 |
| 2.5.1 PCR扩增目的基因 | 第39-40页 |
| 2.5.2 目的片段亚克隆的阳性克隆的筛选及双酶切鉴定 | 第40-41页 |
| 2.5.3 目的基因的序列及分析 | 第41-42页 |
| 2.5.4 重组表达载体的PCR筛选及酶切鉴定 | 第42-43页 |
| 2.6 讨论 | 第43-44页 |
| 2.6.1 关于丝氨酸胰蛋白酶 | 第43-44页 |
| 2.6.2 关于PCR扩增及基因克隆 | 第44页 |
| 2.7 本章小结 | 第44-45页 |
| 第三章 黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶基因在毕赤酵母中的电转化及转化子的筛选 | 第45-54页 |
| 3.1 实验准备 | 第45-47页 |
| 3.1.1 质粒载体及菌种 | 第45页 |
| 3.1.2 试剂和酶制剂 | 第45页 |
| 3.1.3 缓冲液与常用试剂的配制 | 第45-46页 |
| 3.1.4 主要仪器 | 第46-47页 |
| 3.2 实验方法 | 第47-50页 |
| 3.2.1 重组表达质粒的提取 | 第47页 |
| 3.2.2 制备毕赤酵母菌体GS115感受态细胞 | 第47页 |
| 3.2.3 重组质粒的线性化 | 第47-48页 |
| 3.2.4 电转化 | 第48页 |
| 3.2.5 转化子的筛选(使用MM和MD平板) | 第48-49页 |
| 3.2.6 重组酵母菌株基因组DNA的提取 | 第49-50页 |
| 3.2.7 基因组DNA的PCR鉴定 | 第50页 |
| 3.3 结果与分析 | 第50-52页 |
| 3.3.1 重组毕赤酵母的表型确定 | 第50-51页 |
| 3.3.2 重组毕赤酵母的PCR鉴定 | 第51页 |
| 3.3.3 高拷贝转化子的筛选 | 第51-52页 |
| 3.4 讨论 | 第52-53页 |
| 3.4.1 重组质粒的线性化问题 | 第52页 |
| 3.4.2 毕赤酵母的转化方法问题 | 第52-53页 |
| 3.5 本章小结 | 第53-54页 |
| 第四章 黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶基因在毕赤酵母中的表达及活性检测 | 第54-63页 |
| 4.1 实验准备 | 第54-56页 |
| 4.1.1 试剂与培养基 | 第54-56页 |
| 4.1.2 主要仪器 | 第56页 |
| 4.2 实验方法 | 第56-59页 |
| 4.2.1 Mut~+表型重组酵母的诱导表达实验 | 第56-57页 |
| 4.2.2 发酵上清中蛋白的提取 | 第57页 |
| 4.2.3 SDS-PAGE凝胶的制备 | 第57-58页 |
| 4.2.4 浓缩上清的SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳 | 第58页 |
| 4.2.5 纤溶平板测定酶活力 | 第58-59页 |
| 4.3 结果与分析 | 第59-61页 |
| 4.3.1 重组菌的诱导表达 | 第59-60页 |
| 4.3.2 透析后产物的活性检测 | 第60-61页 |
| 4.4 讨论 | 第61-62页 |
| 4.4.1 毕赤酵母表达系统与大肠杆菌表达系统的比较 | 第61-62页 |
| 4.4.2 纤溶平板法 | 第62页 |
| 4.5 本章小结 | 第62-63页 |
| 结论 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-70页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第70-72页 |
| 致谢 | 第72页 |
