| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 前言 | 第12-13页 |
| 第一章 论文综述 | 第13-22页 |
| 1.1 鸭肝炎病毒的分类 | 第13页 |
| 1.2 鸭肝炎病毒基因组结构和功能 | 第13-15页 |
| 1.2.1 DHV-1的非编码区 | 第13-14页 |
| 1.2.2 DHV-1结构蛋白 | 第14页 |
| 1.2.3 非结构蛋白 | 第14-15页 |
| 1.3 鸭肝炎病毒的形态和生物学特征 | 第15页 |
| 1.4 鸭肝炎病毒的流行病学调查 | 第15页 |
| 1.5 鸭肝炎病毒的致病机理 | 第15-16页 |
| 1.6 鸭肝炎病毒的临床症状 | 第16页 |
| 1.7 鸭肝炎病毒的组织学病变 | 第16-17页 |
| 1.8 鸭肝炎病毒的诊断 | 第17-19页 |
| 1.8.1 中和实验 | 第17页 |
| 1.8.2 荧光抗体检测技术 | 第17页 |
| 1.8.3 琼脂扩散试验 | 第17-18页 |
| 1.8.4 胶体金技术 | 第18页 |
| 1.8.5 酶联免疫吸附试验 | 第18-19页 |
| 1.8.6 核酸检测技术 | 第19页 |
| 1.9 化学发光酶免疫分析法 | 第19-22页 |
| 1.9.1 化学发光酶免疫分析法原理 | 第19页 |
| 1.9.2 CLEIA的发光底物 | 第19-20页 |
| 1.9.3 化学发光酶免疫分析法的分类 | 第20页 |
| 1.9.4 化学发光免疫分析仪的组成 | 第20-22页 |
| 第二章 VP1原核重组表达质粒的构建及重组蛋白的表达纯化 | 第22-40页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-25页 |
| 2.1.1 实验仪器 | 第22页 |
| 2.1.2 实验试剂 | 第22页 |
| 2.1.3 毒株 | 第22-23页 |
| 2.1.4 常用缓冲溶液 | 第23-25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-31页 |
| 2.2.1 pET-32a-VP1重组质粒的构建 | 第25页 |
| 2.2.2 RT-PCR扩增 | 第25-26页 |
| 2.2.3 DNA片段的回收 | 第26-27页 |
| 2.2.4 限制性内切酶酶切反应 | 第27页 |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 | 第27页 |
| 2.2.6 连接反应 | 第27-28页 |
| 2.2.7 连接产物的转化 | 第28页 |
| 2.2.8 阳性克隆的鉴定 | 第28-29页 |
| 2.2.9 原核表达重组蛋白的可溶性检测 | 第29页 |
| 2.2.10 重组质粒pET-28a/pET32a-VP1诱导表达条件的优化 | 第29-30页 |
| 2.2.11 目的蛋白的洗涤 | 第30页 |
| 2.2.12 目的蛋白的纯化 | 第30-31页 |
| 2.2.13 Bradford法测定蛋白浓度 | 第31页 |
| 2.3 结果与分析 | 第31-37页 |
| 2.3.1 DHAV-1 VP1基因的扩增 | 第31-32页 |
| 2.3.2 重组原核表达质粒的构建 | 第32页 |
| 2.3.3 重组质粒pET-28a/pET-32a-VP1菌液PCR鉴定结果 | 第32-33页 |
| 2.3.4 序列测定和分析 | 第33-34页 |
| 2.3.5 重组VP1蛋白表达形式的鉴定 | 第34-35页 |
| 2.3.6 重组质粒pET-28a/pET32a-VP1诱导表达条件的优化 | 第35-37页 |
| 2.3.7 重组蛋白VP1的纯化 | 第37页 |
| 2.3.8 蛋白VP1的浓度测定 | 第37页 |
| 2.4 讨论 | 第37-40页 |
| 2.4.1 DHAV-1 VP1蛋白的优势 | 第37-38页 |
| 2.4.2 表达系统的选择 | 第38-39页 |
| 2.4.3 目的蛋白的纯化 | 第39-40页 |
| 第三章 鸭甲肝病毒1型的VP1-ELISA检测方法的建立 | 第40-52页 |
| 3.1 实验材料 | 第40-41页 |
| 3.1.1 实验仪器 | 第40页 |
| 3.1.2 抗原和实验试剂 | 第40页 |
| 3.1.3 ELISA主要试剂的配方 | 第40-41页 |
| 3.2 实验方法 | 第41-43页 |
| 3.2.1 常规间接ELISA检测抗体试验步骤 | 第41页 |
| 3.2.2 蛋白最佳包被浓度的确定 | 第41页 |
| 3.2.3 最佳封闭液的确定 | 第41页 |
| 3.2.4 最佳稀释液的确定 | 第41页 |
| 3.2.5 血清最佳稀释倍数的确定 | 第41-42页 |
| 3.2.6 酶标二抗最佳稀释倍数的确定 | 第42页 |
| 3.2.7 底物最佳作用时间的确定 | 第42页 |
| 3.2.8 临界值的确定 | 第42页 |
| 3.2.9 特异性试验 | 第42页 |
| 3.2.10 灵敏度试验 | 第42页 |
| 3.2.11 重复性试验 | 第42-43页 |
| 3.2.12 ELISA方法与血清中和试验的比较 | 第43页 |
| 3.3 结果与分析 | 第43-50页 |
| 3.3.1 蛋白最佳包被浓度的确定 | 第43页 |
| 3.3.2 最佳封闭液的确定 | 第43-44页 |
| 3.3.3 最佳稀释液的确定 | 第44页 |
| 3.3.4 血清最佳稀释倍数的确定 | 第44-45页 |
| 3.3.5 酶标二抗最佳稀释倍数的确定 | 第45页 |
| 3.3.6 底物最佳作用时间的确定 | 第45-46页 |
| 3.3.7 临界值的确定 | 第46-47页 |
| 3.3.8 特异性试验 | 第47页 |
| 3.3.9 灵敏度试验 | 第47-48页 |
| 3.3.10 重复性试验 | 第48-49页 |
| 3.3.11 间接ELISA方法与血清中和试验的比较 | 第49-50页 |
| 3.4 讨论 | 第50-52页 |
| 3.4.1 间接ELISA方法的特点 | 第50页 |
| 3.4.2 抗原纯度对间接ELISA的影响 | 第50页 |
| 3.4.3 间接ELISA工作条件的确定 | 第50-51页 |
| 3.4.4 临界值的判定 | 第51页 |
| 3.4.5 间接ELISA方法与中和试验的比较 | 第51-52页 |
| 第四章 鸭甲肝病毒1型VP1-CLEIA检测方法的建立 | 第52-63页 |
| 4.1 实验材料 | 第52-53页 |
| 4.1.1 实验仪器 | 第52页 |
| 4.1.2 抗原和实验试剂 | 第52页 |
| 4.1.3 CLEIA主要试剂的配方 | 第52-53页 |
| 4.2 实验方法 | 第53-55页 |
| 4.2.1 常规CLEIA方法测定抗体的试验步骤 | 第53页 |
| 4.2.2 蛋白最佳包被浓度的确定 | 第53页 |
| 4.2.3 最佳封闭液的确定 | 第53页 |
| 4.2.4 最佳稀释液的确定 | 第53页 |
| 4.2.5 血清最佳稀释倍数的确定 | 第53-54页 |
| 4.2.6 酶标二抗最佳稀释倍数的确定 | 第54页 |
| 4.2.7 底物最佳作用时间的确定 | 第54页 |
| 4.2.8 临界值的确定 | 第54页 |
| 4.2.9 特异性试验 | 第54页 |
| 4.2.10 灵敏度试验 | 第54页 |
| 4.2.11 重复性试验 | 第54-55页 |
| 4.2.12 CLEIA方法与中和试验的比较 | 第55页 |
| 4.3 结果与分析 | 第55-61页 |
| 4.3.1 蛋白最佳包被浓度的确定 | 第55页 |
| 4.3.2 最佳封闭液的确定 | 第55-56页 |
| 4.3.3 最佳稀释液的确定 | 第56页 |
| 4.3.4 血清最佳稀释倍数的确定 | 第56-57页 |
| 4.3.5 酶标二抗最佳稀释倍数的确定 | 第57页 |
| 4.3.6 底物最佳作用时间的确定 | 第57页 |
| 4.3.7 临界值的确定 | 第57-58页 |
| 4.3.8 特异性试验 | 第58-59页 |
| 4.3.9 灵敏度试验 | 第59页 |
| 4.3.10 CLEIA的板内和板间重复性试验 | 第59-61页 |
| 4.3.11 CLEIA方法与中和试验的比较 | 第61页 |
| 4.4 讨论 | 第61-63页 |
| 4.4.1 CLEIA的底物特征和最佳工作条件的确定 | 第61-62页 |
| 4.4.2 CLEIA临界值的确定 | 第62页 |
| 4.4.3 CLEIA方法、间接ELISA方法与中和试验的比较 | 第62-63页 |
| 第五章 结论 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-70页 |
| 附录1 英文缩写对照表 | 第70-71页 |
| 附录2 重组质粒pET-28a-VP1测序结果 | 第71-72页 |
| 附录3 重组质粒pET-32a-VP1测序结果 | 第72-73页 |
| 附录4 重组质粒pET-28a/pET-32a-VP1的测序结果与DHAV-1 R85952毒株的序列比对 | 第73-75页 |
| 附录5 VP1基因核苷酸同源性分析 | 第75-76页 |
| 致谢 | 第76-77页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第77页 |
