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E3泛素连接酶RNF138功能和分子机制以及RNF138和CTCF对DNA损伤应答分子机制的研究

中文摘要第6-8页
英文摘要第8-10页
前言第11-13页
材料与方法第13-47页
    材料第13-22页
        1. 实验动物第13页
        2. 菌株第13页
        3. 质粒载体第13-16页
        4. 细胞系与培养基第16页
        5. 实验中用到的细胞系第16页
        6. 工具酶及DNA分子量标准第16-17页
        7. 试剂盒第17页
        8. 抗体第17-18页
        9. 主要仪器、设备和软件名称第18页
        10. 引物的设计和合成第18-21页
        11. SIRNA的设计与合成第21-22页
    方法第22-47页
        12. 基因克隆第22-25页
            12.1 目的片断的扩增第22页
            12.2 PCR产物回收第22-23页
            12.3 PCR产物的克隆第23页
            12.4 突变体编码片段的扩增第23-24页
            12.5 质粒转化与提取第24-25页
            12.6 酶切鉴定第25页
            12.7 测序鉴定第25页
        13. 细胞总RNA的提取和反转录第25-27页
            13.1 TRIzol法细胞总RNA提取第25-26页
            13.2 逆转录第26-27页
        14. 细胞培养相关实验第27-28页
            14.1 细胞复苏第27页
            14.2 细胞传代第27页
            14.3 细胞冻存第27-28页
            14.4 细胞转染第28页
        15. 蛋白分析相关实验第28-34页
            15.1 蛋白提取第28-29页
            15.2 蛋白定量第29-30页
            15.3 蛋白电泳、转膜与Western blot第30-32页
            15.4 免疫共沉淀实验第32-33页
            15.5 细胞免疫荧光实验第33-34页
        16. 细胞增殖相关实验第34-35页
            16.1 Cell Counting Kit-8(CCK-8)法绘制生长曲线测细胞增殖第34-35页
            16.2 平板克隆形成实验测细胞增殖第35页
            16.3 实验数据处理第35页
        17. 慢病毒稳定细胞系的建立第35-37页
            17.1 重组慢病毒的包装第35-36页
            17.2 慢病毒感染细胞第36页
            17.3 流式分选第36-37页
        18. 串联亲和纯化第37-38页
        19. 体内泛素化第38-39页
        20. 稳定性实验第39-40页
        21. 基因敲除动物模型的制备相关实验第40-44页
            21.1 RNF138条件性基因敲除小鼠制备第40页
            21.2 基因组抽提及小鼠基因型鉴定第40-41页
            21.3 细胞凋TUNEL检测第41页
            21.4 小鼠精母细胞荧光免疫染色第41-42页
            21.5 细胞倍型分析第42页
            21.6 小鼠组织收集和固定第42页
            21.7 精子计数第42页
            21.8 睾丸组织石蜡包埋及切片第42-43页
            21.9 HE染色第43-44页
        22. 转录组测序分析相关实验第44-46页
            22.1 实验流程第44-45页
            22.2 信息分析流程第45-46页
        23. DNA损伤修复相关实验第46-47页
            23.1 激光诱导损伤第46页
            23.2 细胞染色体组分分离第46页
            23.3 彗星实验第46页
            23.4 同源重组效率检测第46-47页
结果第47-96页
    1. RNF138基因敲除小鼠模型的建立、表型分析、功能和机制研究第47-57页
        1.1 RNF138基因条件性敲除小鼠的制备及鉴定第47-48页
        1.2 基因敲除小鼠打靶载体构建及ES细胞的筛选鉴定第48-49页
        1.3 基因敲除小鼠和条件性敲除小鼠模型的获得和鉴定第49-50页
        1.4 RNF138在小鼠睾丸中的表达和定位第50-51页
        1.5 RNF138基因敲除小鼠睾丸形态分析第51-52页
        1.6 RNF138基因敲除小鼠精子发生组织形态的影响第52-53页
        1.7 RNF138基因敲除对睾丸支持细胞的影响第53页
        1.8 小鼠睾丸支持细胞RNF138敲除对生殖细胞发育的影响第53-54页
        1.9 RNF138基因敲除对精原细胞数量的影响第54页
        1.10 RNF138基因敲除对精母细胞的影响第54-55页
        1.11 小鼠RNF138敲除导致精母细胞减少的原因第55-56页
        1.12 条件性敲除RNF138基因对小鼠生育力的影响第56-57页
    2. 敲除RNF138基因小鼠及对照小鼠睾丸深度测序分析第57-69页
        2.1 测序样本的验证第57页
        2.2 测序组装结果及统计第57-60页
        2.3 基因结构分析第60-61页
        2.4 SSR分析第61-62页
        2.5 基因表达量分析第62-63页
        2.6 RNA-Seq整体质量评估第63-64页
        2.7 差异表达分析第64-66页
        2.8 基因功能注释第66-69页
    3. 泛素连接酶RNF138在同源重组修复通路的功能和机制研究第69-82页
        3.1 RNF138可以被招募到DNA损伤部位第70-71页
        3.2 RNF138可以通过ATM在Ser124磷酸化第71-74页
        3.3 RNF138积累的DNA损伤位点通过其锌指结构域第74-76页
        3.4 RNF138在调控HR修复途径参与第76-77页
        3.5 RNF138参与DNA损伤修复第77-79页
        3.6 RNF138泛素化RAD51D促进同源重组修复第79-82页
    4. 锌指结构CTCF在DNA损伤应答中识别PAR第82-96页
        4.1 前言第82页
        4.2 CTCF是DNA损伤反应蛋白可以招募到DNA损伤第82-84页
        4.3 CTCF招募到DNA损伤位点通过PAR介导第84-85页
        4.4 CTCF的ZNF结构域识别PAR第85-87页
        4.5 CTCF招募到DNA损伤位点ZNF4-6第87-89页
        4.6 ZNF4-6 CTCF域识别PAR第89-91页
        4.7 CTCF与PAR结合和与DNA结合的关系研究第91-92页
        4.8 CTCF参与DNA损伤修复第92-94页
        4.9 介导的DNA损伤的DNA损伤反应中表征DNA损伤修复区域的边界第94-96页
讨论第96-98页
结论第98-99页
参考文献第99-107页
附录:英汉名词对照第107-108页
综述第108-126页
    参考文献第117-126页
博士在读期间论文与会议摘要写作情况第126-128页
致谢第128页

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