| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 1 前言 | 第11-20页 |
| 1.1 橡胶树病害 | 第11页 |
| 1.2 橡胶树炭疽病 | 第11-12页 |
| 1.2.1 炭疽病发生情况 | 第11-12页 |
| 1.2.2 病原学 | 第12页 |
| 1.3 炭疽菌的致病机理研究 | 第12-13页 |
| 1.4 真菌效应蛋白的研究进展 | 第13-16页 |
| 1.5 BASP(Biotrophy-associated Secreted Proteins)效应蛋白 | 第16页 |
| 1.6 CFEM型效应蛋白 | 第16-17页 |
| 1.7 丝状真菌基因敲除研究进展 | 第17-18页 |
| 1.8 研究目的和意义 | 第18-19页 |
| 1.9 技术路线 | 第19-20页 |
| 2 材料与方法 | 第20-32页 |
| 2.1 植物材料、菌株、质粒、试剂 | 第20页 |
| 2.2 实验仪器 | 第20-21页 |
| 2.3 培养基和试剂配方 | 第21-22页 |
| 2.4 橡胶树炭疽病菌基因组DNA和总RNA的提取 | 第22-23页 |
| 2.4.1 SDS法提取橡胶树炭疽病菌的基因组DNA | 第22页 |
| 2.4.2 橡胶炭疽病菌总RNA提取 | 第22-23页 |
| 2.5 橡胶树炭疽病菌CgBASP2和CgCFEM3基因的克隆 | 第23-24页 |
| 2.6 橡胶树胶孢炭疽病菌CgBASP2和CgCFEM3基因生物信息学分析 | 第24页 |
| 2.7 载体的构建 | 第24-25页 |
| 2.7.1 CgBASP2和CgCFEM3敲除载体的构建 | 第24页 |
| 2.7.2 CgBASP2互补载体的构建 | 第24页 |
| 2.7.3 CgCFEM3GUS表达载体的构建 | 第24-25页 |
| 2.7.4 pUC19-35S-CgCFEM3-FLAG载体的构建 | 第25页 |
| 2.8 用氯化铯密度梯度离心的方法大提质粒 | 第25-26页 |
| 2.9 橡胶树胶孢炭疽病菌原生质体的制备和转化 | 第26页 |
| 2.9.1 橡胶树胶孢炭疽病菌原生质体的制备 | 第26页 |
| 2.9.2 橡胶树胶孢炭疽病菌原生质体转化 | 第26页 |
| 2.10 胶孢炭疽病菌转化子的鉴定 | 第26-27页 |
| 2.11 转化子菌落表型的观察和菌落直径的测量 | 第27页 |
| 2.12 转化子孢子计数 | 第27页 |
| 2.13 转化子分泌特性分析 | 第27页 |
| 2.14 转化子碳源利用分析 | 第27页 |
| 2.15 橡胶树离体叶片的接种实验 | 第27页 |
| 2.16 转化子机械穿透力分析 | 第27-28页 |
| 2.16.1 玻璃纸穿透力分析 | 第27-28页 |
| 2.16.2 洋葱表皮活体穿透力分析 | 第28页 |
| 2.17 转化子纤维素酶活力测定 | 第28-29页 |
| 2.17.1 粗酶液的提取 | 第28页 |
| 2.17.2 纤维素酶活力测定的原理与方法 | 第28页 |
| 2.17.3 葡萄糖标准曲线的绘制 | 第28-29页 |
| 2.18 转化子果胶酶活力测定 | 第29-30页 |
| 2.18.1 粗酶液的提取 | 第29页 |
| 2.18.2 果胶酶活力测定的原理与方法 | 第29页 |
| 2.18.3 半乳糖醛酸标准曲线的绘制 | 第29-30页 |
| 2.19 转化子抗逆性分析 | 第30页 |
| 2.20 转化子活性氧(ROS)检测 | 第30页 |
| 2.21 CgCFEM3效应蛋白在植物中的表达情况 | 第30-32页 |
| 3 结果与分析 | 第32-52页 |
| 3.1 CgBASP2基因的结果与分析 | 第32-42页 |
| 3.1.1 CgBASP2基因扩增及序列分析 | 第32-34页 |
| 3.1.2 CgBASP2基因的敲除突变体构建与验证 | 第34页 |
| 3.1.3 △CgBASP2互补菌株△CgBASP2+basp2的构建与验证 | 第34-35页 |
| 3.1.4 △CgBASP2的生物学特性分析 | 第35-37页 |
| 3.1.5 △CgBASP2的致病力分析 | 第37-38页 |
| 3.1.6 △CgBASP2菌丝机械穿透力的影响 | 第38-39页 |
| 3.1.7 △CgBASP2纤维素酶和果胶酶的活力测定 | 第39-40页 |
| 3.1.8 △CgBASP2对氧化胁迫的抗性分析 | 第40-41页 |
| 3.1.9 △CgBASP2菌丝体中活性氧(ROS)检测 | 第41-42页 |
| 3.2 CgCFEM3基因结果与分析 | 第42-52页 |
| 3.2.1 CgCFEM3基因扩增及序列分析 | 第42-44页 |
| 3.2.2 CgCFEM3胞外分泌特性分析 | 第44-45页 |
| 3.2.3 CgCFEM3在橡胶树叶片原生质体中的表达情况分析 | 第45页 |
| 3.2.4 CgCFEM3基因的敲除突变体构建与验证 | 第45-46页 |
| 3.2.5 △CgCFEM3的生物学特性分析 | 第46-48页 |
| 3.2.6 △CgCFEM3的致病力分析 | 第48页 |
| 3.2.7 △CgCFEM3机械穿透力分析 | 第48-49页 |
| 3.2.8 △CgCFEM3对氧化胁迫的抗性分析 | 第49-50页 |
| 3.2.9 △CgCFEM3菌丝体中活性氧(ROS)检测 | 第50-52页 |
| 4 讨论 | 第52-54页 |
| 4.1 炭疽菌CgBASP2基因 | 第52-53页 |
| 4.2 炭疽菌CgCFEM3基因 | 第53-54页 |
| 5 结论 | 第54-55页 |
| 5.1 CgBASP2基因的分离和初步功能分析 | 第54页 |
| 5.2 CgCFEM3基因的分离和初步功能分析 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-60页 |
| 附录一 本实验所用PCR引物 | 第60-61页 |
| 附录二 琼脂糖凝胶回收目的片段 | 第61-62页 |
| 附录三 目的片段连接、质粒转化反应 | 第62-63页 |
| 附录四 碱裂解法提取质粒 | 第63-64页 |
| 附录五 SDS-PAGE凝胶电泳 | 第64-65页 |
| 致谢 | 第65页 |
