| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 前言 | 第14-20页 |
| 1 马红球菌病概述 | 第14-15页 |
| 1.1 R. equi的流行概况 | 第14-15页 |
| 1.2 马红球菌病的临床症状及诊断 | 第15页 |
| 1.3 马红球菌病的防治 | 第15页 |
| 2 R. equi毒力相关蛋白研究概况 | 第15-18页 |
| 2.1 致病性与非致病性R. equi的区别 | 第16页 |
| 2.2 致病性R. equi毒力相关蛋白概述 | 第16-17页 |
| 2.3 毒力相关蛋白Vap A的研究进展 | 第17-18页 |
| 3 马红球菌病流行病学调查研究进展 | 第18-19页 |
| 3.1 马红球菌病的病原学调查情况 | 第18页 |
| 3.2 马红球菌病的血清学调查概况 | 第18-19页 |
| 4 本研究的目的意义 | 第19-20页 |
| 第一部分 马红球菌毒力相关蛋白Vap A的表达与纯化 | 第20-39页 |
| 1 材料 | 第20-23页 |
| 1.1 菌种与质粒 | 第20页 |
| 1.2 主要试剂及耗材 | 第20页 |
| 1.3 主要溶液的配置 | 第20-22页 |
| 1.4 主要仪器及设备 | 第22-23页 |
| 2 方法 | 第23-31页 |
| 2.1 R. equi的复苏与培养 | 第23页 |
| 2.2 引物设计 | 第23-24页 |
| 2.3 Vap A基因的PCR扩增与克隆 | 第24-28页 |
| 2.3.1 Vap A基因的PCR扩增 | 第24页 |
| 2.3.2 Vap A基因PCR产物的回收纯化 | 第24-25页 |
| 2.3.3 Vap A基因PCR产物与p Zero Back/blunt vector的连接 | 第25-26页 |
| 2.3.4 连接产物转化E.coli DH5α 感受态细胞 | 第26页 |
| 2.3.5 可疑菌落的筛选 | 第26页 |
| 2.3.6 重组质粒p Zero Back-Vap A的提取 | 第26-27页 |
| 2.3.7 重组质粒p Zero Back-Vap A的双酶切与测序鉴定 | 第27-28页 |
| 2.4 原核表达重组质粒p MAL-Vap A的构建与鉴定 | 第28页 |
| 2.5 可溶性重组蛋白r Vap A的表达及最佳诱导条件的确定 | 第28-29页 |
| 2.5.1 IPTG诱导温度的确定 | 第28-29页 |
| 2.5.2 IPTG诱导时间的确定 | 第29页 |
| 2.5.3 IPTG诱导浓度的确定 | 第29页 |
| 2.6 重组蛋白r Vap A的SDS-PAGE分析 | 第29-30页 |
| 2.7 可溶性重组蛋白r Vap A的非变性纯化 | 第30-31页 |
| 2.7.1 蛋白粗提 | 第30页 |
| 2.7.2 r Vap A的亲和层析 | 第30-31页 |
| 2.8 重组蛋白r Vap A的抗原性分析 | 第31页 |
| 3 结果 | 第31-36页 |
| 3.1 Vap A基因的PCR扩增 | 第31-32页 |
| 3.2 重组质粒p Zero Back-Vap A的鉴定 | 第32-33页 |
| 3.3 重组质粒p MAL-Vap A的鉴定 | 第33页 |
| 3.4 重组蛋白的表达条件优化 | 第33-36页 |
| 3.4.1 重组蛋白的诱导表达以及最佳IPTG诱导温度的确定 | 第33-34页 |
| 3.4.2 最佳IPTG诱导浓度与时间的确定 | 第34-35页 |
| 3.4.3 重组蛋白的纯化 | 第35-36页 |
| 3.5 重组蛋白r Vap A的抗原性分析 | 第36页 |
| 4 讨论 | 第36-38页 |
| 4.1 重组蛋白r Vap A中MBP的作用 | 第37页 |
| 4.2 重组蛋白r Vap A的诱导表达与纯化 | 第37-38页 |
| 5 结论 | 第38-39页 |
| 第二部分 马红球菌病抗体间接ELISA检测方法的建立及其血清流行病学调查 | 第39-57页 |
| 1 材料 | 第39页 |
| 1.1 参比血清及主要试剂材料 | 第39页 |
| 1.2 主要溶液的配制 | 第39页 |
| 2 方法 | 第39-42页 |
| 2.1 抗原包被浓度及血清最佳稀释度的确定 | 第40页 |
| 2.2 酶标二抗最佳工作浓度的确定 | 第40页 |
| 2.3 封闭液的选择 | 第40页 |
| 2.4 ELISA临界值的确定 | 第40页 |
| 2.5 重复性试验 | 第40页 |
| 2.6 特异性试验 | 第40-41页 |
| 2.7 R. equi血清流行病学调查 | 第41-42页 |
| 2.7.1 马血清样本的采集 | 第41页 |
| 2.7.2 马血清样本的检测 | 第41页 |
| 2.7.3 统计学分析 | 第41-42页 |
| 3 结果 | 第42-53页 |
| 3.1 抗原包被浓度及血清最佳稀释度的确定 | 第42-43页 |
| 3.2 酶标二抗最佳工作浓度的确定 | 第43-44页 |
| 3.3 封闭液的选择 | 第44页 |
| 3.4 ELISA临界值的确定 | 第44-45页 |
| 3.5 重复性试验 | 第45页 |
| 3.6 特异性试验 | 第45-46页 |
| 3.7 R. equi血清流行病学调查 | 第46-53页 |
| 3.7.1 马匹致病性R. equi血清抗体阳性率 | 第46-48页 |
| 3.7.2 致病性R. equi血清抗体水平的地区差异 | 第48-49页 |
| 3.7.3 马匹致病性R. equi血清抗体水平的种间差异 | 第49-50页 |
| 3.7.4 马匹致病性R. equi血清抗体水平的性别差异 | 第50-51页 |
| 3.7.5 致病性R. equi血清抗体水平的季节差异 | 第51-52页 |
| 3.7.6 致病性R. equi血清抗体水平与马匹年龄的相关性分析 | 第52-53页 |
| 4 讨论 | 第53-56页 |
| 4.1 R. equi间接ELISA检测方法的建立 | 第53-54页 |
| 4.2 血清流行病学调查 | 第54-56页 |
| 4.2.1 我国致病性R. equi血清抗体阳性率与世界各地区的比较 | 第54页 |
| 4.2.2 我国地区间致病性R. equi血清抗体水平差异的分析 | 第54-55页 |
| 4.2.3 我国马匹致病性R. equi血清抗体水平的季节特点 | 第55页 |
| 4.2.4 我国马匹致病性R. equi血清抗体水平的性别特点 | 第55-56页 |
| 4.2.5 我国马匹致病性R. equi血清抗体水平的品种特点 | 第56页 |
| 4.2.6 我国马匹致病性R. equi血清抗体水平的年龄特点 | 第56页 |
| 5 结论 | 第56-57页 |
| 第三部分 马红球菌菌落印记检测方法的建立及其病原流行病学调查 | 第57-77页 |
| 1 材料 | 第57-58页 |
| 1.1 菌株及主要试剂材料 | 第57页 |
| 1.2 实验动物 | 第57页 |
| 1.3 引物 | 第57页 |
| 1.4 主要溶液的配制 | 第57-58页 |
| 2 方法 | 第58-64页 |
| 2.1 R. equi的常规分离与细菌生化鉴定 | 第58-59页 |
| 2.2 R. equi的PCR鉴定 | 第59页 |
| 2.3 16S r RNA测序鉴定 | 第59页 |
| 2.4 R. equi菌落印记检测方法的建立 | 第59-62页 |
| 2.4.1 多克隆抗体的制备 | 第59-60页 |
| 2.4.2 阳性样本的处理及细菌培养 | 第60页 |
| 2.4.3 菌落印记法反应条件的优化 | 第60-61页 |
| 2.4.4 特异性检测 | 第61-62页 |
| 2.4.5 灵敏度检测 | 第62页 |
| 2.5 R. equi流行病学调查 | 第62-64页 |
| 2.5.1 土壤样本的采集 | 第62-63页 |
| 2.5.2 土壤样本的分离鉴定 | 第63-64页 |
| 2.5.3 马匹各活动区域R. equi分布情况分析 | 第64页 |
| 3 结果 | 第64-73页 |
| 3.1 致病性与非致病性R. equi的培养特性及生化特征 | 第64页 |
| 3.2 R. equi的PCR鉴定 | 第64-65页 |
| 3.3 土壤选择性培养分离菌株的 16S r RNA测序鉴定 | 第65页 |
| 3.4 R. equi菌落印记检测方法的建立 | 第65-69页 |
| 3.4.1 多克隆抗体的制备 | 第65-66页 |
| 3.4.2 菌落印记法反应条件的优化 | 第66-67页 |
| 3.4.3 菌落印记法检测鉴定标准的确定 | 第67-68页 |
| 3.4.4 特异性检测 | 第68-69页 |
| 3.5 R. equi的PCR鉴定法与菌落印记法的灵敏度比较 | 第69-70页 |
| 3.6 R. equi病原流行病学调查 | 第70-73页 |
| 3.6.1 R. equi PCR鉴定法 | 第70-71页 |
| 3.6.2 R. equi菌落印记检测方法 | 第71页 |
| 3.6.3 R. equi PCR鉴定法与菌落印记法的比较 | 第71-72页 |
| 3.6.4 马场各活动区域土壤R. equi分布情况分析 | 第72-73页 |
| 4 讨论 | 第73-76页 |
| 4.1 常规R. equi分离鉴定、16S r RNA测序鉴定以及PCR鉴定 | 第73-74页 |
| 4.2 R. equi菌落印记检测方法 | 第74页 |
| 4.3 R. equi流行病学调查 | 第74-75页 |
| 4.4 R. equi病原学与血清学调查结果比对 | 第75-76页 |
| 5 结论 | 第76-77页 |
| 全文总结 | 第77-78页 |
| 致谢 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-85页 |
| 附录I 硕士期间研究成果 | 第85-86页 |
| 附录II 16SrRNA测序鉴定菌株 | 第86-90页 |
