| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第1章 研究背景 | 第14-36页 |
| 1.1 霉酚酸研究概况 | 第14-15页 |
| 1.1.1 霉酚酸简介 | 第14页 |
| 1.1.2 霉酚酸酯药理作用简介 | 第14-15页 |
| 1.1.3 霉酚酸酯在临床上的重要性 | 第15页 |
| 1.1.4 霉酚酸酯在临床上的不良反应 | 第15页 |
| 1.2 霉酚酸生产菌株的选育 | 第15-17页 |
| 1.2.1 生产菌株及霉酚酸的生物合成方式 | 第15页 |
| 1.2.2 多种方式进行霉酚酸高产菌株的选育 | 第15-16页 |
| 1.2.3 营养缺陷型菌株的选育 | 第16页 |
| 1.2.4 紫外线诱变筛选育种 | 第16页 |
| 1.2.5 低能量离子注入法诱变育种 | 第16页 |
| 1.2.6 抗药性菌株的筛选 | 第16-17页 |
| 1.3 霉酚酸发酵技术研究进展 | 第17-19页 |
| 1.3.1 固体发酵生产霉酚酸 | 第17页 |
| 1.3.2 液体发酵培养霉酚酸 | 第17页 |
| 1.3.3 接种量和发酵条件对于霉酚酸液体发酵的影响 | 第17页 |
| 1.3.4 菌丝结球对于霉酚酸发酵的影响 | 第17-18页 |
| 1.3.5 响应面分析法优化发酵培养基 | 第18页 |
| 1.3.6 新型RFB发酵罐放大实验提高发酵产量 | 第18页 |
| 1.3.7 霉酚酸的提取工艺 | 第18-19页 |
| 1.4 抗生素发酵和分离纯化工艺优化的研究进展 | 第19-26页 |
| 1.4.1 培养基成分优化对于抗生素发酵的影响 | 第19-21页 |
| 1.4.2 培养基组分优化 | 第21-23页 |
| 1.4.3 抗生素发酵参数控制的影响 | 第23-25页 |
| 1.4.4 抗生素分离纯化技术 | 第25-26页 |
| 1.5 丝状病原真菌遗传转化的研究进展 | 第26-31页 |
| 1.5.1 PEG-CaC12介导转化法 | 第26页 |
| 1.5.2 限制内切酶介导转化法 | 第26-27页 |
| 1.5.3 基因枪转化法 | 第27页 |
| 1.5.4 电击转化法 | 第27页 |
| 1.5.5 根癌农杆菌介导转化法 | 第27-31页 |
| 1.6 透明颤菌血红蛋白(VHb)的克隆表达 | 第31-34页 |
| 1.6.1 透明颤菌和血红蛋白简介 | 第31-32页 |
| 1.6.2 透明颤菌血红蛋白的基因克隆、表达与调控 | 第32-33页 |
| 1.6.3 透明颤菌血红蛋白基因在发酵生产中的应用 | 第33-34页 |
| 1.6.4 在植物细胞中转化的应用 | 第34页 |
| 1.7 本课题研究背景、目的与主要内容 | 第34-36页 |
| 1.7.1 研究背景和意义 | 第34页 |
| 1.7.2 研究内容和目标 | 第34-36页 |
| 第2章 响应面设计优化霉酚酸发酵培养基 | 第36-52页 |
| 2.1 引言 | 第36页 |
| 2.2 材料与方法 | 第36-39页 |
| 2.2.1 实验菌种 | 第36-37页 |
| 2.2.2 实验仪器和材料 | 第37-38页 |
| 2.2.3 培养基 | 第38-39页 |
| 2.3 分析方法 | 第39-40页 |
| 2.3.1 菌体干重测定 | 第39页 |
| 2.3.2 霉酚酸产量测定方法 | 第39-40页 |
| 2.4 实验流程和方案依据及原理说明 | 第40-41页 |
| 2.4.1 实验流程 | 第40页 |
| 2.4.2 培养基的优化方案 | 第40-41页 |
| 2.4.3 实验线路 | 第41页 |
| 2.5 结果和讨论 | 第41-51页 |
| 2.5.1 培养基重要因素考察 | 第41-46页 |
| 2.5.2 响应面分析试验设计筛选显著因素的最优水平 | 第46-50页 |
| 2.5.3 响应面结果上罐验证 | 第50-51页 |
| 2.6 本章小结 | 第51-52页 |
| 第3章 组合补料策略提高短密青霉发酵生产霉酚酸的产量 | 第52-61页 |
| 3.1 引言 | 第52页 |
| 3.2 材料与方法 | 第52-53页 |
| 3.2.1 实验菌种 | 第52页 |
| 3.2.2 实验仪器和试剂 | 第52-53页 |
| 3.2.3 培养基和培养方法 | 第53页 |
| 3.2.4 分析方法 | 第53页 |
| 3.2.5 实验线路 | 第53页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第53-60页 |
| 3.3.0 短密青霉在7L发酵罐中发酵生产霉酚酸 | 第54页 |
| 3.3.1 发酵策略调控时间点的确定 | 第54页 |
| 3.3.2 F-CN碳氮源CN比流加补料策略 | 第54页 |
| 3.3.3 F-pH调控发酵策略 | 第54页 |
| 3.3.4 F-Met前体物补加发酵策略 | 第54-55页 |
| 3.3.5 三种补料策略分别在7L发酵罐中的验证 | 第55-57页 |
| 3.3.6 F-CPM组合补料策略的发酵实验 | 第57-58页 |
| 3.3.7 各种发酵策略相关参数分析 | 第58-60页 |
| 3.4 本章小结 | 第60-61页 |
| 第4章 透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在短密青霉菌中的克隆表达 | 第61-74页 |
| 4.1 引言 | 第61页 |
| 4.2 实验材料 | 第61-64页 |
| 4.2.1 菌种 | 第61页 |
| 4.2.2 质粒 | 第61页 |
| 4.2.3 培养基 | 第61-62页 |
| 4.2.4 主要溶液配方 | 第62页 |
| 4.2.5 常用抗生素溶液的配制 | 第62-63页 |
| 4.2.6 实验仪器和试剂 | 第63-64页 |
| 4.3 实验方法 | 第64-67页 |
| 4.3.1 ATCC16024全基因组提取和PCR鉴定 | 第64-65页 |
| 4.3.2 pPK3质粒扩增 | 第65-66页 |
| 4.3.3 电转法转化pPK3-vgb入农杆菌LBA4404感受态 | 第66页 |
| 4.3.4 阳性重组子的菌落PCR鉴定 | 第66页 |
| 4.3.5 根癌农杆菌感受态细胞的制备 | 第66-67页 |
| 4.4 根癌农杆菌LBA4404介导转化 | 第67-68页 |
| 4.4.1 根癌农杆菌分生孢子的孢悬液的制备 | 第67页 |
| 4.4.2 根癌农杆菌的培养及处理 | 第67页 |
| 4.4.3 根癌农杆菌介导短密青霉ATCC16024的遗传转化 | 第67页 |
| 4.4.4 vgb基因的提取 | 第67页 |
| 4.4.5 pPK3-vgb的构建 | 第67-68页 |
| 4.4.6 vgb基因在农杆菌LBA4404中的表达 | 第68页 |
| 4.4.7 农杆菌介导vgb基因转入ATCC16024 | 第68页 |
| 4.4.8 验证vgb基因引入短密青霉ATCC16024 | 第68页 |
| 4.4.9 转化子的Southern blot分析 | 第68页 |
| 4.5 结果与讨论 | 第68-72页 |
| 4.5.1 中间载体pPK3-vgb质粒构建 | 第68-70页 |
| 4.5.2 转化子PCR验证分析和Southern blot验证 | 第70-71页 |
| 4.5.3 CO差示光谱法检验VHb蛋白的表达 | 第71页 |
| 4.5.4 转化子发酵生产霉酚酸 | 第71-72页 |
| 4.6 本章小结 | 第72-74页 |
| 第5章 敲除短密青霉HMG-CoA裂解酶基因提高霉酚酸发酵产量 | 第74-93页 |
| 5.1 引言 | 第74-75页 |
| 5.2 材料和方法 | 第75页 |
| 5.2.1 菌种和质粒 | 第75页 |
| 5.2.2 培养条件 | 第75页 |
| 5.2.3 主要溶液配方 | 第75页 |
| 5.2.4 常用抗生素溶液的配制 | 第75页 |
| 5.2.5 实验仪器和试剂 | 第75页 |
| 5.3 实验方法 | 第75-82页 |
| 5.3.1 巢式PCR | 第75-78页 |
| 5.3.2 巢式PCR引物设计 | 第78-80页 |
| 5.3.3 短密青霉ATCC16024的HMG-CoA裂解酶基因敲除 | 第80-82页 |
| 5.3.4 电转法转化pPK3-hlb-hrb质粒入农杆菌LBA4404感受态 | 第82页 |
| 5.3.5 根癌农杆菌感受态细胞的制备 | 第82页 |
| 5.4 根癌农杆菌LBA4404介导转化 | 第82-83页 |
| 5.4.1 根癌农杆菌介导转化及转化子的筛选鉴定 | 第82-83页 |
| 5.4.2 分子PCR鉴定 | 第83页 |
| 5.4.3 发酵验证 | 第83页 |
| 5.4.4 阳性重组子的菌落PCR鉴定 | 第83页 |
| 5.4.5 抗性筛选 | 第83页 |
| 5.4.6 转化子的Southern Blot验证 | 第83页 |
| 5.4.7 转化子的HMG-CoA裂解含量测定 | 第83页 |
| 5.5 结果与讨论 | 第83-91页 |
| 5.5.1 基因克隆获得HMG-CoA裂解酶序列 | 第83-87页 |
| 5.5.2 巢式PCR得到ATCC16024的4个关键酶基因序列片段 | 第87-89页 |
| 5.5.3 转化子PCR验证结果 | 第89-90页 |
| 5.5.4 HMG-CoA裂解酶含量检测 | 第90-91页 |
| 5.5.5 转化子AHL-4发酵生产霉酚酸 | 第91页 |
| 5.6 本章小结 | 第91-93页 |
| 第6章 结论与展望 | 第93-96页 |
| 6.1 结论 | 第93-94页 |
| 6.1.1 发酵培养基配方优化 | 第93页 |
| 6.1.2 组合补料策略F-CPM的建立 | 第93-94页 |
| 6.1.3 根癌农杆菌介导vgb在短密青霉菌中的克隆表达 | 第94页 |
| 6.1.4 代谢途径改造提高霉酚酸发酵产量的研究 | 第94页 |
| 6.2 展望 | 第94-96页 |
| 参考文献 | 第96-106页 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 | 第106-108页 |
| 致谢 | 第108页 |
