| 摘要 | 第11-12页 |
| Abstract | 第12-13页 |
| 1 前言 | 第14-26页 |
| 1.1 猪流感病毒概况 | 第14-18页 |
| 1.1.1 猪流感病毒的形态和结构 | 第14-15页 |
| 1.1.2 猪流感病毒的基因结构及其编码的蛋白 | 第15-18页 |
| 1.1.2.1 聚合酶 | 第15页 |
| 1.1.2.2 血凝素（HA） | 第15-16页 |
| 1.1.2.3 神经氨酸酶（NA） | 第16-17页 |
| 1.1.2.4 核蛋白（NP） | 第17页 |
| 1.1.2.5 基质蛋白(M) | 第17-18页 |
| 1.1.2.6 非结构蛋白(NS) | 第18页 |
| 1.2 猪流感病毒发展史 | 第18-19页 |
| 1.3 猪流感病毒流行病学调查状况 | 第19页 |
| 1.4 流感病毒反向遗传学发展历程 | 第19-21页 |
| 1.4.1 核糖核蛋白转染法 | 第20页 |
| 1.4.2 RNA聚合酶I法 | 第20页 |
| 1.4.3 17（或 12）质粒系统 | 第20-21页 |
| 1.4.4 8质粒系统 | 第21页 |
| 1.5 猪流感病毒检测方法 | 第21-26页 |
| 1.5.1 猪流感病毒血清学检测方法 | 第21-24页 |
| 1.5.1.1 猪流感病毒的分离 | 第21页 |
| 1.5.1.2 血凝与血凝抑制试验 | 第21-22页 |
| 1.5.1.3 神经氨酸酶抑制试验 | 第22页 |
| 1.5.1.4 琼脂扩散沉淀试验 | 第22-23页 |
| 1.5.1.5 酶联免疫吸附试验 | 第23页 |
| 1.5.1.6 病毒中和试验 | 第23页 |
| 1.5.1.7 免疫荧光抗体检测技术 | 第23页 |
| 1.5.1.8 胶体金免疫标记法 | 第23-24页 |
| 1.5.2 猪流感病毒分子生物学检测方法 | 第24-26页 |
| 1.5.2.1 逆转录-聚合酶链反应 | 第24页 |
| 1.5.2.2 实时荧光定量RT-PCR | 第24页 |
| 1.5.2.3 依赖核酸序列的扩增技术 | 第24-25页 |
| 1.5.2.4 基因芯片技术 | 第25页 |
| 1.5.2.5 逆转录—环介导等温核酸扩增技术 | 第25页 |
| 1.5.2.6 焦测序技术 | 第25-26页 |
| 2 材料与方法 | 第26-39页 |
| 2.1 实验材料 | 第26-28页 |
| 2.1.1 毒株和质粒 | 第26页 |
| 2.1.2 细胞和菌种 | 第26页 |
| 2.1.3 试验动物 | 第26页 |
| 2.1.4 试验仪器及耗材 | 第26-27页 |
| 2.1.5 主要试剂及配制 | 第27-28页 |
| 2.1.5.1 试剂 | 第27页 |
| 2.1.5.2 试剂配制 | 第27-28页 |
| 2.2 试验方法 | 第28-39页 |
| 2.2.1 流行病学调查 | 第28-29页 |
| 2.2.1.1 病毒扩增 | 第28页 |
| 2.2.1.2 制备 1%豚鼠血红细胞 | 第28页 |
| 2.2.1.3 血凝试验 | 第28-29页 |
| 2.2.1.4 猪血清处理 | 第29页 |
| 2.2.1.5 血凝抑制实验 | 第29页 |
| 2.2.2 动物试验 | 第29-31页 |
| 2.2.2.1 病毒滴定 | 第29-30页 |
| 2.2.2.2 细胞接毒试验 | 第30页 |
| 2.2.2.3 病毒生长曲线绘制 | 第30页 |
| 2.2.2.4 小鼠攻毒试验 | 第30-31页 |
| 2.2.3 构建反向遗传操作平台 | 第31-39页 |
| 2.2.3.1 引物设计 | 第31-32页 |
| 2.2.3.2 病毒RNA提取及其反转录 | 第32-33页 |
| 2.2.3.3 扩增基因片段 | 第33页 |
| 2.2.3.4 RT-PCR产物回收，鉴定及纯化 | 第33-34页 |
| 2.2.3.5 胶回收产物及载体质粒的酶切 | 第34-35页 |
| 2.2.3.6 重组质粒的构建 | 第35页 |
| 2.2.3.7 转化 | 第35-36页 |
| 2.2.3.8 重组质粒的鉴定 | 第36-37页 |
| 2.2.3.9 重组质粒的抽提纯化 | 第37-38页 |
| 2.2.3.10 拯救病毒 | 第38页 |
| 2.2.3.11 重组病毒的鉴定 | 第38-39页 |
| 3 结果与分析 | 第39-46页 |
| 3.1 血凝试验 | 第39页 |
| 3.2 血凝抑制试验 | 第39页 |
| 3.3 病毒滴定 | 第39-40页 |
| 3.4 TJ6在MDCK细胞的特性 | 第40-41页 |
| 3.4.1 接种MDCK细胞上的细胞病变 | 第40页 |
| 3.4.2 TJ6在MDCK细胞上的生长曲线 | 第40-41页 |
| 3.5 小鼠攻毒试验数据 | 第41-43页 |
| 3.5.1 小鼠体重变化曲线 | 第41-42页 |
| 3.5.2 小鼠肺脏中病毒TCID50的检测 | 第42页 |
| 3.5.3 小鼠肺脏切片HE染色观察 | 第42-43页 |
| 3.6 反向遗传平台建立结果 | 第43-46页 |
| 3.6.1 RT-PCR扩增试验结果 | 第43-44页 |
| 3.6.2 重组质粒PBD菌液鉴定结果 | 第44页 |
| 3.6.3 MDCK细胞接种原始毒株和拯救毒株细胞病变观察 | 第44-45页 |
| 3.6.4 拯救毒株RT-PCR鉴定结果 | 第45-46页 |
| 4 讨论 | 第46-48页 |
| 5 结论 | 第48-49页 |
| 参考文献 | 第49-53页 |
| 致谢 | 第53页 |