| 中文摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-12页 |
| 目录 | 第12-16页 |
| 前言 | 第16-21页 |
| 第一节 应用质谱技术鉴定PINK1蛋白自磷酸化修饰位点的研究 | 第21-41页 |
| 1 材料与仪器 | 第21-27页 |
| ·主要仪器 | 第21-22页 |
| ·主要试剂、耗材及试剂的配制 | 第22-27页 |
| 2 实验方法 | 第27-35页 |
| ·野生型PINK1原核表达质粒载体的构建 | 第27-31页 |
| ·大肠杆菌中蛋白质诱导表达 | 第31页 |
| ·平衡G4B(Glutathione Sepharose 4B) | 第31-32页 |
| ·GST蛋白的纯化 | 第32页 |
| ·蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第32-33页 |
| ·GST-Tag融合蛋白的大量纯化 | 第33-34页 |
| ·体外磷酸化反应(In Vitro Phosphorylation Assay) | 第34页 |
| ·生物质谱技术(北京蛋白质组研究中心)检测磷酸化修饰位点 | 第34-35页 |
| 3 结果 | 第35-38页 |
| ·构建野生型PFNK1的原核表达质粒 | 第35-36页 |
| ·GST-PINK1融合蛋白的大量纯化 | 第36-37页 |
| ·运用质谱技术鉴定PINK1蛋白的自身磷酸化修饰位点 | 第37-38页 |
| 4 分析与讨论 | 第38-41页 |
| 第二节 野生型PINK1蛋白自身磷酸化修饰的研究 | 第41-59页 |
| 1 材料与仪器 | 第41-47页 |
| ·主要仪器 | 第41-42页 |
| ·主要试剂、耗材及试剂的配制 | 第42-47页 |
| 2 实验方法 | 第47-55页 |
| ·S465A突变型PINK1原核表达质粒载体的构建(TaKaRa MutanBEST Kit) | 第47-51页 |
| ·大肠杆菌中蛋白质诱导表达 | 第51页 |
| ·平衡G4B(Glutathione Sepharose 4B) | 第51页 |
| ·GST蛋白的纯化 | 第51-52页 |
| ·蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第52-53页 |
| ·GST-Tag融合蛋白的大量纯化 | 第53-54页 |
| ·体外磷酸化反应(In Vitro Phosphorylation Assay)和放射自显影 | 第54页 |
| ·实验分组 | 第54页 |
| ·数据统计及分析 | 第54-55页 |
| 3 结果 | 第55-58页 |
| ·构建S465A突变型PINK1的原核表达质粒 | 第55-56页 |
| ·GST-PINK1融合蛋白的大量纯化 | 第56页 |
| ·体外磷酸化和放射自显影 | 第56-58页 |
| 4 分析与讨论 | 第58-59页 |
| 第三节 突变型PINK1蛋白对其激酶活性的影响 | 第59-80页 |
| 1 材料与仪器 | 第59-65页 |
| ·主要仪器 | 第59-60页 |
| ·主要试剂、耗材及试剂的配制 | 第60-65页 |
| 2 实验方法 | 第65-73页 |
| ·T313M、R492X突变型PINK1原核表达质粒载体的构建 | 第65-69页 |
| ·大肠杆菌中蛋白质诱导表达 | 第69-70页 |
| ·平衡G4B(Glutathione Sepharose 4B) | 第70页 |
| ·GST蛋白的纯化 | 第70页 |
| ·蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第70-71页 |
| ·GST-Tag融合蛋白的大量纯化 | 第71-72页 |
| ·体外磷酸化反应(In Vitro Phosphorylation Assay)和放射自显影 | 第72-73页 |
| ·实验分组 | 第73页 |
| ·数据统计及分析 | 第73页 |
| 3 结果 | 第73-78页 |
| ·构建T313M、R492X突变型PINK1的原核表达质粒 | 第73-74页 |
| ·野生型及突变型GST-PINK1融合蛋白的大量纯化 | 第74-76页 |
| ·野生型和突变型GST-PINK1融合蛋白磷酸化底物酪蛋白的活性的比较 | 第76-78页 |
| 4 分析与讨论 | 第78-80页 |
| 第四节 突变型PINK1蛋白对于亚细胞定位的影响 | 第80-95页 |
| 1 材料与仪器 | 第80-84页 |
| ·主要仪器 | 第80-81页 |
| ·主要试剂、耗材及试剂的配制 | 第81-84页 |
| 2 实验方法 | 第84-90页 |
| ·S465A/S465D突变型PINK1真核表达质粒载体的构建 | 第84-87页 |
| ·HEK 293细胞培养 | 第87-88页 |
| ·细胞转染(脂质体转染法) | 第88-89页 |
| ·实验分组 | 第89页 |
| ·细胞免疫化学染色 | 第89-90页 |
| ·细胞的荧光观察 | 第90页 |
| 3 结果 | 第90-93页 |
| ·构建S465D突变型PINK1的原核表达质粒 | 第90-92页 |
| ·构建S465A/S465D突变型PINK1的真核表达质粒 | 第92页 |
| ·在荧光显微镜下观察细胞免疫荧光化学染色结果 | 第92-93页 |
| 4 分析与讨论 | 第93-95页 |
| 第五节 突变型PINK1蛋白对于其自身降解的影响 | 第95-107页 |
| 1 材料与仪器 | 第95-100页 |
| ·主要仪器 | 第95页 |
| ·材料与试剂 | 第95-100页 |
| 2 实验方法 | 第100-105页 |
| ·HEK 293细胞培养 | 第100-101页 |
| ·细胞转染(脂质体转染法) | 第101-102页 |
| ·实验分组 | 第102页 |
| ·Chase-time | 第102-103页 |
| ·Western-blotting | 第103-105页 |
| 3 结果 | 第105页 |
| 4 分析与讨论 | 第105-107页 |
| 第六节 突变型PINK1对于Parkin亚细胞定位的影响 | 第107-119页 |
| 1 材料与仪器 | 第107-109页 |
| ·主要仪器 | 第107页 |
| ·主要试剂、耗材及试剂的配制 | 第107-109页 |
| 2 实验方法 | 第109-114页 |
| ·HEK 293细胞培养 | 第109-111页 |
| ·细胞转染(脂质体转染法) | 第111页 |
| ·实验分组 | 第111-112页 |
| ·细胞免疫化学染色 | 第112-113页 |
| ·细胞的荧光观察 | 第113页 |
| ·共转染后含有野生型及突变型PINK1与Parkin共定位的阳性细胞计数 | 第113-114页 |
| 3 结果 | 第114-117页 |
| ·荧光显微镜下观察共转染后野生型及突变型PINK1与Parkin的亚细胞定位 | 第114-116页 |
| ·共转染后含野生型及突变型PINK1与Parkin共定位的阳性细胞计数统计 | 第116-117页 |
| 4 分析与讨论 | 第117-119页 |
| 结论 | 第119-120页 |
| 参考文献 | 第120-126页 |
| 综述 | 第126-137页 |
| 参考文献 | 第130-137页 |
| 攻读学位期间的主要研究成果目录 | 第137-138页 |
| 致谢 | 第138-139页 |
