| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-14页 |
| 前言 | 第14-19页 |
| 第一部分 IgE高亲和力受体FcεRIα亚基细胞外区表达质粒的构建及鉴定 | 第19-36页 |
| 1 材料 | 第19-20页 |
| ·主要试剂 | 第19页 |
| ·质粒与菌株 | 第19页 |
| ·引物合成 | 第19页 |
| ·血清来源 | 第19页 |
| ·主要仪器 | 第19-20页 |
| 2 方法 | 第20-25页 |
| ·引物设计 | 第20-21页 |
| ·外周血嗜碱性粒细胞分离 | 第21页 |
| ·RNA提取 | 第21页 |
| ·目的基因调取 | 第21-22页 |
| ·RT反应体系 | 第21页 |
| ·PCR扩增 | 第21-22页 |
| ·原核重组质粒FcεRIα-pMD-18T的构建 | 第22-23页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第22页 |
| ·转化 | 第22-23页 |
| ·目的基因的酶切、回收 | 第23页 |
| ·融合表达载体FcεRIα-pET28a(+)的构建 | 第23-24页 |
| ·目的基因片段与载体的连接 | 第23页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第23-24页 |
| ·转化 | 第24页 |
| ·重组克隆的筛选及鉴定 | 第24-25页 |
| ·初步鉴定 | 第24页 |
| ·DNA酶切鉴定 | 第24页 |
| ·PCR鉴定 | 第24-25页 |
| ·基因序列测定 | 第25页 |
| 3 结果 | 第25-32页 |
| ·RT-PCR结果 | 第25-26页 |
| ·扩增FcεRIα基因的琼脂糖电泳分析 | 第25页 |
| ·PCR条件优化 | 第25-26页 |
| ·FcεRIα-pMD18-T重组质粒的构建及鉴定 | 第26-31页 |
| ·重组质粒与空载体比较鉴定图 | 第26-27页 |
| ·酶切鉴定重组质粒FcεRIα-pMD18-T | 第27页 |
| ·测序鉴定 | 第27-31页 |
| ·FcεRIα-pET28a(+)重组表达质粒的构建和鉴定 | 第31-32页 |
| 4 讨论 | 第32-35页 |
| 5 小结 | 第35-36页 |
| 第二部分 重组蛋白的表达、纯化及复性 | 第36-51页 |
| 1 材料 | 第36-38页 |
| ·主要试剂 | 第36页 |
| ·主要仪器 | 第36页 |
| ·溶液及培养基配制 | 第36-38页 |
| ·SDS-PAGE试剂 | 第36-37页 |
| ·细菌培养基 | 第37页 |
| ·目的蛋白变性液、复性液以及蛋白纯化缓冲液 | 第37-38页 |
| 2 方法 | 第38-41页 |
| ·重组蛋白的诱导表达 | 第38页 |
| ·蛋白表达条件的优化 | 第38-39页 |
| ·最佳诱导时机的选择 | 第38页 |
| ·最佳收菌时间的选择 | 第38-39页 |
| ·最佳IPTG诱导浓度的选择 | 第39页 |
| ·可溶性表达条件的选择 | 第39页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第39-41页 |
| ·包涵体的提取 | 第39页 |
| ·包涵体的洗涤 | 第39-40页 |
| ·变性产物的纯化 | 第40页 |
| ·包涵体的复性 | 第40页 |
| ·复性条件的优化 | 第40-41页 |
| 3 结果 | 第41-47页 |
| ·重组质粒的表达 | 第41页 |
| ·表达条件的优化 | 第41-44页 |
| ·包含体提纯及初步洗涤 | 第44-46页 |
| ·目的蛋白的纯化-Ni-NTA亲和纯化 | 第46-47页 |
| 4 讨论 | 第47-50页 |
| 5 小结 | 第50-51页 |
| 第三部分 单克隆抗体的制备及鉴定 | 第51-61页 |
| 1 材料 | 第51-52页 |
| ·试剂 | 第51页 |
| ·细胞与动物 | 第51页 |
| ·主要仪器 | 第51页 |
| ·主要试剂配制 | 第51-52页 |
| 2 方法 | 第52-56页 |
| ·抗原制备 | 第52-53页 |
| ·动物免疫 | 第53页 |
| ·效价测定 | 第53页 |
| ·细胞融合 | 第53-54页 |
| ·杂交瘤细胞株的筛 | 第54-55页 |
| ·单克隆抗体特异性鉴定 | 第55-56页 |
| ·ELISA鉴定 | 第55页 |
| ·细胞免疫荧光鉴定 | 第55-56页 |
| ·McAb效价测定 | 第56页 |
| 3 结果 | 第56-58页 |
| ·杂交瘤细胞株的建立 | 第56-57页 |
| ·抗体的特异性鉴定 | 第57页 |
| ·单克隆抗体培养上清的效价 | 第57-58页 |
| 4 讨论 | 第58-60页 |
| 5 小结 | 第60-61页 |
| 全文小结 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-67页 |
| 附录一:综述 | 第67-73页 |
| 附录二:缩略词 | 第73-75页 |
| 硕士期间发表论文情况 | 第75-76页 |
| 致谢 | 第76-78页 |
