| 第一章 文献综述 | 第1-22页 |
| 前言 | 第8页 |
| 一 转基因林木的生态安全性 | 第8-16页 |
| 1 基因流与转基因逃逸对近缘物种的潜在威胁及对策 | 第8-9页 |
| ·基因流与转基因逃逸对近缘物种的潜在威胁 | 第8页 |
| ·转基因杨树的生态安全性评估 | 第8-9页 |
| ·防止花粉污染的对策 | 第9页 |
| 2 转基因林木对非靶标生物的影响 | 第9-10页 |
| 3 标记基因的安全性问题 | 第10页 |
| 4 解决使用选择标记基因存在的问题的方法有 | 第10-16页 |
| ·完全避免使用标记基因 | 第10-11页 |
| ·去除选择标记基因的方法 | 第11-13页 |
| ·共转化法 | 第11页 |
| ·Ac/Ds转座系统 | 第11-12页 |
| ·位点特异性重组系统 | 第12-13页 |
| ·利用位点特异性重组去除叶绿体DNA中标记基因 | 第13页 |
| ·筛选标记基因的失活 | 第13页 |
| ·组织特异性表达选择标记基因 | 第13-14页 |
| ·有色基因 | 第14页 |
| ·无争议的生物安全标记基因 | 第14-16页 |
| ·有关于激素代谢的基因 | 第15页 |
| ·有关于糖类代谢的基因 | 第15-16页 |
| ·有关氨基酸代谢的基因 | 第16页 |
| 二 绿色荧光蛋白基因 | 第16-18页 |
| 1 与其余两种常用报告基因Gus和Luc相比,GFP具有极大的优越性 | 第17页 |
| 2 GFP监测转基因植物中选择标记基因的消除中的作用 | 第17-18页 |
| ·共转化中的监测 | 第17-18页 |
| ·位点特异性重组中的监测 | 第18页 |
| 三 甘露糖异构酶基因作为筛选体系 | 第18-22页 |
| 1 原理 | 第18-19页 |
| 2 PMI转化系统的影响因素 | 第19-20页 |
| 3 安全性评价 | 第20-22页 |
| ·敏感性测试 | 第20页 |
| ·毒性测试 | 第20-21页 |
| ·农艺性状 | 第21页 |
| ·组成分析 | 第21-22页 |
| 第二章 材料与方法 | 第22-38页 |
| 1 PMI基因克隆 | 第22-26页 |
| ·材料 | 第22页 |
| ·质粒和菌株 | 第22页 |
| ·酶和试剂 | 第22页 |
| ·仪器与设备 | 第22页 |
| ·培养基 | 第22页 |
| ·方法 | 第22-26页 |
| ·PCR反应模板DNA的制备 | 第22-26页 |
| ·细菌染色体总DNA的提取 | 第22-23页 |
| ·直接用改进型菌落PCR法得到目的基因 | 第23页 |
| ·PCR扩增反应引物的设计 | 第23页 |
| ·PCR反应体系 | 第23-24页 |
| ·PCR反应程序 | 第24页 |
| ·目标片段PCR产物的分离纯化 | 第24页 |
| ·回收片段与T-载体的连接 | 第24页 |
| ·用CaCl_2制备大肠杆菌感受态细胞 | 第24-25页 |
| ·大肠杆菌转化及蓝白斑筛选方法 | 第25页 |
| ·转化子的进一步鉴定 | 第25页 |
| ·T-vector克隆测序 | 第25-26页 |
| 2 植物表达载体的构建 | 第26-36页 |
| ·材料 | 第26页 |
| ·质粒和菌株 | 第26页 |
| ·酶和试剂 | 第26页 |
| ·仪器与设备 | 第26页 |
| ·方法 | 第26-30页 |
| ·质粒提取方法 | 第26-27页 |
| ·酶切和终止 | 第27-28页 |
| ·DNA片段回收 | 第28页 |
| ·DNA片段末端碱基去磷酸化 | 第28页 |
| ·目的片段和载体连接 | 第28页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第28页 |
| ·连接反应产物的转化 | 第28-29页 |
| ·重组质粒的α互补检测 | 第29页 |
| ·农杆菌感受态细胞的制备 | 第29页 |
| ·液氮冻融法转化农杆菌 | 第29页 |
| ·细菌培养 | 第29-30页 |
| ·PMI正选择标记系统表达载体构建路线 | 第30-33页 |
| ·PCR两端直接设计酶切位点做xhoI酶切 | 第30-31页 |
| ·使用中间载体构建 | 第31-33页 |
| ·含有报告基因GFP的PMI正选择标记系统表达 | 第33-34页 |
| ·含有抗病基因NP-1的PMI正选择标记系统表达载体的构建 | 第34-35页 |
| ·含有双价抗病基因的PMI正选择标记系统表达载体的构建 | 第35-36页 |
| 3 甘露糖异构酶基因筛选系统的初步探讨 | 第36-38页 |
| ·材料 | 第36页 |
| ·方法 | 第36-37页 |
| ·叶片分化的mannose敏感性测试 | 第36页 |
| ·叶盘转化法 | 第36-37页 |
| ·绿色荧光蛋白基因的检测 | 第37-38页 |
| 第三章 结果与分析 | 第38-51页 |
| 1 PMI基因克隆 | 第38-41页 |
| ·PMI基因的扩增结果 | 第38页 |
| ·manA基因的克隆结果 | 第38-41页 |
| ·转化子的鉴定 | 第38-39页 |
| ·测序结果 | 第39-41页 |
| 2 PMI正选择标记系统表达载体构建 | 第41-44页 |
| ·表达载体的选择 | 第41-42页 |
| ·酶切的影响因素 | 第42页 |
| ·PCR引物上加酶切位点的构建的相关因素 | 第42页 |
| ·是否要加保护碱基 | 第42页 |
| ·manA基因需要定向克隆到35S启动子和NOS终止子之间基因才能表达 | 第42页 |
| ·中间载体构建过程 | 第42-44页 |
| 3 Positech系统的应用 | 第44-45页 |
| ·含有报告基因GFP的PMI正选择标记系统的构建 | 第44-45页 |
| 4 烟草甘露糖筛选的结果 | 第45-46页 |
| 5 杨树甘露糖筛选的结果 | 第46-47页 |
| 6 杨树叶片的转化 | 第47-48页 |
| 7 甘露糖筛选杨树转化芽的GFP检测 | 第48-51页 |
| 第四章 结论与讨论 | 第51-53页 |
| 1 本文的主要结论是 | 第51页 |
| 2 存在的问题及展望 | 第51-53页 |
| 参考文献 | 第53-58页 |
| 详细摘要 | 第58-60页 |
