| 目录 | 第1-11页 |
| 中文摘要 | 第11-13页 |
| ABSTRACT | 第13-15页 |
| 英文缩写表 | 第15-16页 |
| 前言 | 第16-25页 |
| 第一章 BT811基因文库的构建 | 第25-38页 |
| 1 材料 | 第25-27页 |
| ·菌种和质粒 | 第25页 |
| ·培养基 | 第25页 |
| ·工具酶及试剂盒 | 第25-26页 |
| ·试剂 | 第26页 |
| ·主要溶液 | 第26-27页 |
| ·主要仪器 | 第27页 |
| 2 方法 | 第27-32页 |
| ·BT811基因组DNA的制备 | 第27-28页 |
| ·DNA的定量 | 第28页 |
| ·BT811基因组DNA的部分酶解 | 第28-29页 |
| ·酶反应条件考察 | 第28-29页 |
| ·大量DNA的部分酶切 | 第29页 |
| ·线状DNA的去磷酸化 | 第29-30页 |
| ·pKC505质粒的提取 | 第30页 |
| ·DNA的限制性酶切 | 第30页 |
| ·基因组DNA部分酶切片段与载体臂的连接反应 | 第30-31页 |
| ·连接产物的包装 | 第31页 |
| ·细菌感受态细胞的制备 | 第31页 |
| ·连接产物的包装 | 第31页 |
| ·包装产物的转染 | 第31-32页 |
| ·乙内酰脲酶活性的检测 | 第32页 |
| 3 结果 | 第32-37页 |
| ·基因组文库的构建 | 第32-35页 |
| ·BT811染色体DNA部分酶切片段的制备 | 第34页 |
| ·载体pKC505限制性酶切、去磷酸化 | 第34-35页 |
| ·连接、包装和转染 | 第35页 |
| ·基因文库质量分析 | 第35-36页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第36-37页 |
| 4 讨论 | 第37-38页 |
| 第二章 亚克隆与序列分析 | 第38-57页 |
| 1 材料 | 第38-39页 |
| ·菌种与质粒 | 第38页 |
| ·培养基 | 第38页 |
| ·工具酶及试剂盒 | 第38-39页 |
| ·试剂 | 第39页 |
| ·主要溶液 | 第39页 |
| ·主要仪器 | 第39页 |
| 2 方法 | 第39-42页 |
| ·重组粘粒pKC505-hyu18DNA的制备 | 第39页 |
| ·粘粒pKC505-hyu18DNA的部分酶切 | 第39-40页 |
| ·DNA片段的纯化 | 第40页 |
| ·克隆载体pUC18的制备 | 第40页 |
| ·外源DNA与质粒载体的连接反应 | 第40页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌DH5_α感受态细胞 | 第40-41页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞DH5_α的制备 | 第40-41页 |
| ·连接产物的转化反应 | 第41页 |
| ·阳性亚克隆重组子的筛选 | 第41页 |
| ·DNA序列的测定 | 第41-42页 |
| ·序列分析 | 第42页 |
| 3 结果 | 第42-56页 |
| ·亚克隆 | 第43-44页 |
| ·重组质粒测序结果 | 第44-48页 |
| ·乙内酰脲水解酶基因序列分析 | 第44-46页 |
| ·N-氨甲酰氨基酸水解酶基因序列分析 | 第46-48页 |
| ·重组质粒核苷酸BLAST搜索结果分析 | 第48-54页 |
| ·乙内酰脲水解酶基因序列与AE014340序列比较结果 | 第49-51页 |
| ·N-氨甲酰氨基酸水解酶基因序列比较结果 | 第51-54页 |
| ·氨基酸序列分析结果 | 第54-56页 |
| ·D-乙内酰脲酶氨基酸分析结果 | 第54-55页 |
| ·N-氨甲酰氨基酸水解酶氨基酸分析结果 | 第55-56页 |
| 4 讨论 | 第56-57页 |
| 第三章 乙内酰脲水解酶的表达 | 第57-67页 |
| 1 材料 | 第57-59页 |
| ·菌种和质粒 | 第57页 |
| ·培养基 | 第57页 |
| ·工具酶及试剂盒 | 第57-58页 |
| ·PCR引物 | 第58页 |
| ·试剂 | 第58页 |
| ·主要溶液 | 第58-59页 |
| ·主要仪器 | 第59页 |
| 2 方法 | 第59-62页 |
| ·PCR扩增hyuH基因 | 第59-60页 |
| ·表达质粒pQE60-hyuH的构建、转化与克隆菌株的鉴定 | 第60页 |
| ·阳性克隆的检测 | 第60页 |
| ·诱导表达 | 第60-61页 |
| ·表达产物SDS-PAGE分析 | 第61页 |
| ·乙内酰脲水解酶活性的检测 | 第61页 |
| ·乙内酰脲水解酶活力的测定 | 第61页 |
| ·菌体蛋白含量的测定 | 第61-62页 |
| 3 结果 | 第62-66页 |
| ·乙内酰脲水解酶基因的PCR扩增 | 第62页 |
| ·表达质粒pQE60-hyuH的构建、转化与克隆菌株的鉴定 | 第62-65页 |
| ·hyuH基因表达的SDS-PAGE检测 | 第65页 |
| ·表达产物的生物学活性分析 | 第65-66页 |
| 4 讨论 | 第66-67页 |
| 第四章 N-氨甲酰氨基酸水解酶的表达 | 第67-76页 |
| 1 材料 | 第67-68页 |
| ·菌种和质粒 | 第67页 |
| ·培养基 | 第67页 |
| ·工具酶及试剂盒 | 第67-68页 |
| ·试剂 | 第68页 |
| ·主要溶液 | 第68页 |
| ·主要仪器 | 第68页 |
| 2 方法 | 第68-71页 |
| ·PCR扩增hyuC基因 | 第68-69页 |
| ·表达质粒pQE70-hyuC的构建、转化与克隆菌株的鉴定 | 第69页 |
| ·阳性克隆的检测 | 第69页 |
| ·诱导表达 | 第69-70页 |
| ·表达产物SDS-PAGE分析 | 第70页 |
| ·N-氨甲酰氨基酸水解酶活性的测定 | 第70页 |
| ·N-氨甲酰氨基酸水解酶活力的测定 | 第70页 |
| ·菌体蛋白含量的测定 | 第70-71页 |
| 3 结果 | 第71-75页 |
| ·hyuC基因的PCR扩增 | 第71页 |
| ·表达质粒pQE70-hyuC的构建、转化与克隆菌株的鉴定 | 第71-74页 |
| ·表达质粒pQE70-hyuC的构建、转化 | 第71-73页 |
| ·重组质粒pQE70-hyuC的鉴定 | 第73-74页 |
| ·hyuC基因表达的SDS-PAGE检测 | 第74-75页 |
| ·表达产物的生物学活性分析 | 第75页 |
| 4 讨论 | 第75-76页 |
| 第五章 L-乙内酰脲水解酶三维结构的模建和分析 | 第76-81页 |
| 1 材料与方法 | 第76-77页 |
| ·材料 | 第76-77页 |
| ·模建方法 | 第77页 |
| 2 结果 | 第77-79页 |
| ·酶的结构特征 | 第77-78页 |
| ·酶的活性部位 | 第78-79页 |
| 3 讨论 | 第79-81页 |
| 第六章 重叠延伸PCR法构建乙内酰脲水解酶突变体 | 第81-93页 |
| 1 材料 | 第81-83页 |
| ·菌种和质粒 | 第81-82页 |
| ·培养基 | 第82页 |
| ·工具酶及试剂盒 | 第82页 |
| ·PCR引物 | 第82-83页 |
| ·试剂 | 第83页 |
| ·主要溶液 | 第83页 |
| ·主要仪器 | 第83页 |
| 2 方法 | 第83-85页 |
| ·乙内酰脲水解酶突变体的制备 | 第83-84页 |
| ·模板DNA的制备 | 第84页 |
| ·定点突变质粒pQE70-hyuH的构建、转化与克隆菌株的鉴定 | 第84-85页 |
| ·乙内酰脲水解酶活性的检测 | 第85页 |
| ·突变点序列检测 | 第85页 |
| 3 结果 | 第85-92页 |
| ·147位点突变体的制备(Kcx~(147)→Glu~(147)) | 第85-88页 |
| ·147位点突变PCR扩增 | 第85-87页 |
| ·147位点突变体的测序结果分析 | 第87页 |
| ·147位点突变体的活性检测 | 第87-88页 |
| ·72及97位点突变体的制备(Asn~(72)→Tyr~(72)，Ser~(97)→Phe~(97)) | 第88-92页 |
| ·Asn~(72)→Tyr~7位点突变PCR扩增 | 第88-90页 |
| ·Ser~(97)→Phe~(97)位点突变PCR扩增 | 第90-91页 |
| ·构建质粒的测序结果分析 | 第91页 |
| ·72及97位点突变活性检测结果 | 第91-92页 |
| 4 讨论 | 第92-93页 |
| 结论 | 第93-98页 |
| 参考文献 | 第98-104页 |
| 致谢 | 第104页 |
