| 致谢 | 第1-10页 |
| 缩略语 | 第10-11页 |
| 中文摘要 | 第11-13页 |
| 英文摘要 | 第13-15页 |
| 第一部分 文献综述与实验设计方案 | 第15-37页 |
| 第一章 尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)的研究进展 | 第16-24页 |
| 1 uPA的结构 | 第16-18页 |
| ·类生长因子功能区 | 第16页 |
| ·环状结构域 | 第16-17页 |
| ·蛋白酶功能区 | 第17页 |
| ·连接区 | 第17-18页 |
| 2 uPA的功能 | 第18-19页 |
| ·纤溶作用 | 第18页 |
| ·胞外基质的降解作用 | 第18页 |
| ·信号传导作用 | 第18-19页 |
| 3 uPA的加工过程 | 第19-20页 |
| 4 pro-UK纤维蛋白特异性激活纤溶酶原的作用机制 | 第20-22页 |
| 5 尿激酶型纤溶酶原激活剂的发展与展望 | 第22-24页 |
| 第二章 杆状病毒表达载体系统 | 第24-34页 |
| 1 昆虫杆状病毒表达系统的基本原理 | 第24-25页 |
| 2 转移载体 | 第25-26页 |
| ·转移载体的启动子 | 第25-26页 |
| ·多角体蛋白融合表达的转移载体 | 第26页 |
| ·便于纯化表达产物的的转移载体 | 第26页 |
| ·多元转移载体 | 第26页 |
| 3 重组病毒筛选方法的改进 | 第26-30页 |
| ·线性化病毒DNA技术 | 第26-28页 |
| ·应用YAC操作杆状病毒基因组 | 第28页 |
| ·E.coli Bacmid系统 | 第28-29页 |
| ·体外定点重组 | 第29页 |
| ·neo抗性筛选 | 第29页 |
| ·条件致死性筛选 | 第29-30页 |
| ·产生多角体的重组病毒 | 第30页 |
| 4 影响昆虫系统表达量的因素分析 | 第30-31页 |
| ·细胞类型与质量 | 第30页 |
| ·外源蛋白的性质 | 第30-31页 |
| ·启动子序列完整性 | 第31页 |
| ·融合蛋白 | 第31页 |
| ·其他因素 | 第31页 |
| 5 杆状病毒表达载体系统的特点分析 | 第31-34页 |
| ·高效表达外源基因 | 第32页 |
| ·表达产物后加工比较完全 | 第32页 |
| ·可容纳较大的外源DNA片段 | 第32页 |
| ·适合表达细胞毒性蛋白 | 第32页 |
| ·安全性好 | 第32-34页 |
| 第三章 实验设计方案 | 第34-37页 |
| 1 本实验的目的和意义 | 第34-35页 |
| 2 本研究的主要内容 | 第35-36页 |
| 3 技术路线 | 第36-37页 |
| 第二部分 研究内容 | 第37-78页 |
| 第四章 家蚕杆状病毒重组转移载体的构建 | 第38-55页 |
| ·材料和试剂 | 第38-40页 |
| ·实验方法 | 第40-47页 |
| ·PCR引物的设计与合成 | 第40-41页 |
| ·以质粒pET28-UKAV为模板扩增出目的片段 | 第41页 |
| ·PCR产物的回收 | 第41页 |
| ·连接反应 | 第41-42页 |
| ·E.coil TG1感受态细胞的制备 | 第42页 |
| ·连接产物转化感受态细胞 | 第42页 |
| ·碱法小批量抽提质粒DNA | 第42-43页 |
| ·重组质粒pGEM-UKAV的酶切鉴定 | 第43页 |
| ·重组质粒pGEM-UKAV的PCR鉴定 | 第43-44页 |
| ·基因序列测定 | 第44页 |
| ·重组转移载体pBacPAK-UKAV的构建 | 第44-45页 |
| ·重组转移载体pBacPAK-UKAV的酶切鉴定 | 第45-46页 |
| ·重组转移载体pBacPAK-UKAV的PCR鉴定 | 第46页 |
| ·用High pure plasmid lsolation Kit纯化质粒 | 第46-47页 |
| ·核酸电泳 | 第47页 |
| ·结果与分析 | 第47-54页 |
| ·重组转移载体pBacPAK-UKAV的构建 | 第47-50页 |
| ·克隆载体pGEM-UKAV的鉴定 | 第50-51页 |
| ·转移载体pBacPAK-UKAV的鉴定 | 第51-53页 |
| ·低分子量尿激酶与Annexin V融合基因的序列测定 | 第53-54页 |
| ·小结 | 第54-55页 |
| 第五章 重组家蚕杆状病毒的筛选和鉴定 | 第55-67页 |
| ·材料和试剂 | 第55-56页 |
| ·试验方法 | 第56-63页 |
| ·细胞培养、冻存与复苏 | 第56-57页 |
| ·病毒培养 | 第57页 |
| ·病毒滴度测定 | 第57页 |
| ·Bm-BacPAK6 DNA的提取及酶切线性化 | 第57-58页 |
| ·重组转移质粒与线性化病毒DNA共转染 | 第58页 |
| ·重组病毒的筛选 | 第58-59页 |
| ·重组病毒的PCR鉴定 | 第59-60页 |
| ·重组病毒的DNA Southern杂交鉴定 | 第60-63页 |
| ·结果与讨论 | 第63-67页 |
| ·线型化病毒Bm-BacPAK 6的基因组DAN提取和线性化 | 第63-64页 |
| ·共转染及重组病毒的筛选 | 第64页 |
| ·重组病毒的鉴定 | 第64-66页 |
| ·重组病毒的滴度测定 | 第66-67页 |
| 第六章 低分子量尿激酶与Annexin V融合蛋白在家蚕细胞和幼虫中的表达及活性分析 | 第67-78页 |
| ·材料和试剂 | 第67-69页 |
| ·实验方法 | 第69-72页 |
| ·重组病毒在家蚕培养细胞和5龄幼虫中的表达 | 第69页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE | 第69-70页 |
| ·表达产物的ELISA检测 | 第70页 |
| ·表达产物的Western blotting分析 | 第70-71页 |
| ·表达产物的抗凝活性鉴定 | 第71页 |
| ·纤维蛋白-琼脂糖平板法测定表达产物的纤溶活性 | 第71-72页 |
| ·结果与分析 | 第72-76页 |
| ·ELISA法检测家蚕细胞与家蚕幼虫在不同时间表达低分子量尿激酶和Annexin V融合蛋白的水平 | 第72-73页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE和Western印迹 | 第73-74页 |
| ·表达产物的抗凝活性分析 | 第74-75页 |
| ·表达产物纤溶活性鉴定 | 第75-76页 |
| ·讨论 | 第76-78页 |
| 结论 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-84页 |
| 附录 | 第84-87页 |
