| 中文摘要 | 第1-8页 |
| 英文摘要 | 第8-17页 |
| 专业名词缩写中英文对照表 | 第17-18页 |
| 实验技术路线图 | 第18-19页 |
| 前言 | 第19-26页 |
| 第一章 miR-375基因的克隆和功能的初步分析 | 第26-50页 |
| 1 材料与方法 | 第26-40页 |
| ·材料与试剂 | 第26-28页 |
| ·主要仪器 | 第28页 |
| ·感受态菌种的制备 | 第28-29页 |
| ·小鼠gDNA抽提和以小鼠gDNA为模板扩增miR-375基因 | 第29-30页 |
| ·胶回收miR-375基因扩增产物 | 第30页 |
| ·miR-375基因胶回收纯化产物与T质粒连接 | 第30-31页 |
| ·T-miR-375基因质粒抽提 | 第31页 |
| ·T-miR-375基因阳性克隆菌PCR扩增和T-miR-375基因阳性质粒酶切签定 | 第31-32页 |
| ·pAAV-MCS-miR-375基因质粒的构建 | 第32页 |
| ·pAAV-MCS-miR-375基因阳性克隆菌PCR扩增和pAAV-MCS-miR-375基因阳性质粒的酶切签定 | 第32-33页 |
| ·pAAV-MCS-miR-375转染HeLa细胞 | 第33页 |
| ·转染后HeLa细胞总RNA的获得 | 第33-34页 |
| ·RNA的DNaseI的处理 | 第34页 |
| ·RNA逆转录得到cDNA | 第34页 |
| ·转染后HeLa细胞中miR-375基因表达的检测 | 第34-35页 |
| ·配制8%聚丙烯酰胺 | 第35页 |
| ·pAAV-MCS-miR-375质粒转染Nit-1细胞 | 第35页 |
| ·免疫组化步骤 | 第35-36页 |
| ·Western的步骤 | 第36-38页 |
| ·Nit-1细胞胰岛素的测定 | 第38页 |
| ·pAAV-MCS-RIP-miR-375转基因质粒的构建 | 第38-39页 |
| ·质粒的中量制备 | 第39页 |
| ·转基因质粒片段的制备 | 第39-40页 |
| 2 结果 | 第40-47页 |
| ·pAAV-MCS-miR-375质粒构建 | 第40-42页 |
| ·pAAV-MCS-miR-375在Hela细胞中的表达 | 第42页 |
| ·miR-375对Nit-1细胞中MTPN基因的表达调节 | 第42-44页 |
| ·转基因片段的制备 | 第44-47页 |
| 3 讨论 | 第47-50页 |
| ·成熟miRNA表达质粒构建 | 第47-48页 |
| ·miRNA的功能研究 | 第48-50页 |
| 第二章 转基因小鼠的构建 | 第50-104页 |
| 1 材料与方法 | 第50-72页 |
| ·材料与试剂 | 第50-52页 |
| ·主要仪器 | 第52-53页 |
| ·结扎公鼠 | 第53-54页 |
| ·超排母鼠及受精卵的获得 | 第54页 |
| ·假孕母鼠的准备 | 第54-55页 |
| ·显微注射及输卵管移植 | 第55页 |
| ·鼠尾gDNA的抽提 | 第55-56页 |
| ·PCR筛选 | 第56-57页 |
| ·Slot Blot | 第57-58页 |
| ·Southern Blot分析 | 第58-60页 |
| ·荧光原位杂交实验步骤 | 第60-62页 |
| ·转基因小鼠胰腺中转入基因和胰腺发育相关基因表达 | 第62-63页 |
| ·实时定量PCR检测转基因小鼠胰腺中mRNA水平表达差异 | 第63-65页 |
| ·Western Blot的步骤 | 第65-68页 |
| ·DHPLC检测 | 第68页 |
| ·免疫荧光 | 第68-69页 |
| ·H/E染色 | 第69-70页 |
| ·转基因小鼠小鼠体重血糖的测定 | 第70页 |
| ·转基因小鼠小鼠的糖耐量实验 | 第70页 |
| ·转基因小鼠小鼠空腹血清(Mouse)胰岛素含量的测定 | 第70-72页 |
| 2 结果 | 第72-98页 |
| ·转基因小鼠的构建 | 第72页 |
| ·转基因阳性鼠的筛查 | 第72-77页 |
| ·转基因动物的繁殖 | 第77-79页 |
| ·转基因小鼠生理指标测定 | 第79-83页 |
| ·转基因小鼠染色体G带染色 | 第83-84页 |
| ·转基因小鼠胰腺发育相关基因表达 | 第84-85页 |
| ·转基因小鼠胰脏和肺中MTPN的表达 | 第85-89页 |
| ·转基因小鼠胰腺的病理变化 | 第89-92页 |
| ·转基因小鼠肺中的病理变化 | 第92-98页 |
| 3 讨论 | 第98-103页 |
| ·转基因阳性动物的鉴定 | 第98页 |
| ·miRNA与糖尿病关系 | 第98-100页 |
| ·miRNA的测定和miR-375在转基因胰腺中表达 | 第100-101页 |
| ·miR-375与胰腺的脂肪变性 | 第101-102页 |
| ·miRNA对胰腺发育的影响 | 第102-103页 |
| 小结 | 第103-104页 |
| 第三章 非β-细胞诱导成产生胰岛素细胞的初步研究 | 第104-122页 |
| 1 材料与方法 | 第104-114页 |
| ·质粒载体 | 第104-106页 |
| ·试剂 | 第106页 |
| ·PCR引物 | 第106-107页 |
| ·主要仪器 | 第107页 |
| ·人胰脏总RNA的获得 | 第107-108页 |
| ·RNA逆转录得到胰cDNA | 第108页 |
| ·以人胰脏总cDNA为模板PCR扩增PDX-1基因阅读框架 | 第108-109页 |
| ·人胰脏总cDNA为模板PCR扩增Insulin基因阅读框架 | 第109页 |
| ·PDX-1基因、Insulin基因扩增产物胶回收 | 第109页 |
| ·PDX-1基因、Insulin基因与T质粒连接 | 第109页 |
| ·T-PDX-1、T-Insulin质粒抽提 | 第109页 |
| ·T-PDX-1、T-Insulin阳性克隆菌PCR扩增和阳性质粒酶切签定 | 第109-110页 |
| ·pAAV-MCS-PDX-1质粒的构建 | 第110-111页 |
| ·pAAV-MCS-Insulin质粒的构建 | 第111页 |
| ·293T细胞的培养 | 第111页 |
| ·pAAV-MCS-PDX-1转染293T细胞 | 第111-112页 |
| ·293T细胞总RNA的获得 | 第112页 |
| ·RNA用DNaseI处理 | 第112页 |
| ·用pAAV-MCS-PDX-1和pAAV-MCS-insulin共同转染293T细胞与pAAV-MCS-insulin单独转染293T细胞相比较 | 第112-114页 |
| 2 结果 | 第114-120页 |
| ·pAAV-MCS-PDX-1质粒的构建 | 第114-115页 |
| ·pAAV-MCS-Insulin质粒的构建 | 第115-117页 |
| ·用质粒pAAV-MCS-PDX-1转染293T细胞 | 第117-118页 |
| ·用质粒pAAV-MCS-PDX-1和质粒pAAV-MCS-insulin共转染293T细胞 | 第118-120页 |
| 3 讨论 | 第120-122页 |
| 结论 | 第122-123页 |
| 参考文献 | 第123-130页 |
| 综述1 | 第130-138页 |
| 综述2 | 第138-146页 |
| 致谢 | 第146-147页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 | 第147-148页 |
| 个人简历 | 第148页 |
