| 目录 | 第1-6页 |
| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一章 前言 | 第8-21页 |
| ·几丁质与几丁质酶 | 第8-13页 |
| ·几丁质及其合成途径 | 第8-10页 |
| ·几丁质酶的功能及其分类 | 第10-13页 |
| ·几丁质酶的应用 | 第13-15页 |
| ·几丁质酶基因克隆的策略 | 第15-21页 |
| ·cDNA末端快速扩增技术 | 第15-16页 |
| ·几丁质酶基因克隆与表达的研究进展 | 第16-21页 |
| 第二章 材料与方法 | 第21-44页 |
| ·材料 | 第21页 |
| ·仪器与试剂 | 第21-22页 |
| ·主要仪器 | 第21-22页 |
| ·主要试剂 | 第22页 |
| ·方法 | 第22-44页 |
| ·SDS-PAGE电泳使用溶液的配制 | 第22-23页 |
| ·毕赤酵母表达使用溶液的配制 | 第23-24页 |
| ·真菌DNA的提取 | 第24-25页 |
| ·真菌RNA的提取 | 第25-27页 |
| ·DEPC水、器具和容器的处理 | 第25-26页 |
| ·真菌RNA提取程序 | 第26页 |
| ·RNA的分析和定量 | 第26-27页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第27-28页 |
| ·E.coli DH5α感受态细胞的制备 | 第27-28页 |
| ·毕赤酵母GS115感受态细胞的制备 | 第28页 |
| ·哈茨木霉几丁质酶的诱导 | 第28-31页 |
| ·几丁质酶的诱导 | 第28-29页 |
| ·几丁质酶活力的测定(DNS法) | 第29-30页 |
| ·NAG标准曲线的绘制 | 第30-31页 |
| ·哈茨木霉几丁质酶基因保守区的克隆 | 第31-35页 |
| ·哈茨木霉几丁质酶基因特异片段的PCR扩增 | 第31-32页 |
| ·RT-PCR反应 | 第32-33页 |
| ·几丁质酶基因保守区的纯化、克隆测序 | 第33-35页 |
| ·哈茨木霉几丁质酶基因全长的克隆与序列分析 | 第35-38页 |
| ·cDNA的第一链合成 | 第35-36页 |
| ·cDNA末端的快速扩增(RACE) | 第36-37页 |
| ·哈茨木霉几丁质酶基因全长序列的分析 | 第37-38页 |
| ·毕赤酵母表达载体pPIC9K-Thchit44的构建与验证 | 第38-41页 |
| ·目的DNA片段的PCR产物纯化 | 第38-39页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第39页 |
| ·PCR产物的酶切 | 第39-40页 |
| ·质粒DNA的酶切 | 第40页 |
| ·质粒DNA与目的片段DNA的连接 | 第40-41页 |
| ·毕赤酵母表达载体酶切验证 | 第41页 |
| ·毕赤酵母表达载体的电转化 | 第41-42页 |
| ·线状化质粒DNA | 第41页 |
| ·表达载体的电击转化 | 第41-42页 |
| ·重组子的鉴定 | 第42页 |
| ·重组酵母的诱导表达 | 第42-43页 |
| ·多拷贝His~+Mut~+克隆的筛选 | 第42页 |
| ·重组蛋白的诱导表达 | 第42-43页 |
| ·重组蛋白的SDS-PAGE分离与纯化 | 第43-44页 |
| 第三章 结果与分析 | 第44-58页 |
| ·哈茨木霉诱导产几丁质酶的研究 | 第44页 |
| ·哈茨木霉基因组DNA与总RNA的分离 | 第44-46页 |
| ·哈茨木霉总RNA的分离 | 第44-45页 |
| ·哈茨木霉基因组DNA的提取 | 第45-46页 |
| ·哈茨木霉几丁质酶cDNA特异性片段的RT-PCR扩增 | 第46页 |
| ·哈茨木霉几丁质酶cDNA的3'/5'-RACE扩增 | 第46-47页 |
| ·哈茨木霉几丁质酶基因全序列分析 | 第47-53页 |
| ·哈茨木霉几丁质酶cDNA序列分析 | 第47-48页 |
| ·基因组PCR获得内含子DNA序列 | 第48-52页 |
| ·哈茨木霉几丁质酶三级结构的预测 | 第52-53页 |
| ·不同来源几丁质酶的系统发育分析 | 第53-55页 |
| ·酵母表达载体pPIC9K-Thchit44的构建及鉴定 | 第55-56页 |
| ·酵母表达载体pPIC9K-Thchit44的构建 | 第55页 |
| ·酵母表达载体pPIC9K-Thchit44的鉴定 | 第55-56页 |
| ·重组毕赤酵母的筛选及鉴定 | 第56页 |
| ·重组毕赤酵母的诱导表达及其产物的SDS-PAGE分析 | 第56-58页 |
| 第四章 讨论 | 第58-60页 |
| ·产几丁质酶菌株的筛选 | 第58页 |
| ·几丁质酶基因的表达调控 | 第58-59页 |
| ·几丁质酶基因在生物防治的应用 | 第59页 |
| ·几丁质酶基因的定向改造 | 第59-60页 |
| 第五章 结论 | 第60-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-68页 |
| 附录1. 攻读学位期间发表文章及参加学术交流情况 | 第68-69页 |
| 附录2. 论文所用缩写及中英文对照 | 第69-71页 |
