| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 第一章 绪论 | 第11-20页 |
| 1.1 猪附红细胞体的研究进展 | 第11-16页 |
| 1.1.1 猪附红细胞体的致病性 | 第11页 |
| 1.1.2 猪附红细胞体病的临床症状 | 第11-12页 |
| 1.1.3 猪附红细胞体的传播途径 | 第12页 |
| 1.1.4 猪附红细胞体的检测 | 第12-14页 |
| 1.1.5 猪附红细胞体的相关蛋白 | 第14-15页 |
| 1.1.6 猪附红细胞体的体外培养 | 第15页 |
| 1.1.7 猪附红细胞体的动物模型研究 | 第15-16页 |
| 1.2 疫苗的相关研究 | 第16-19页 |
| 1.2.1 灭活疫苗 | 第16页 |
| 1.2.2 弱毒疫苗 | 第16页 |
| 1.2.3 亚单位疫苗 | 第16-17页 |
| 1.2.4 DNA疫苗 | 第17-18页 |
| 1.2.5 佐剂的应用 | 第18页 |
| 1.2.6 联合免疫方式 | 第18-19页 |
| 1.3 研究目的和意义 | 第19-20页 |
| 第二章 MSG1基因的克隆及其生物信息学分析 | 第20-29页 |
| 2.1 试验材料与仪器 | 第20-21页 |
| 2.1.1 试验材料 | 第20页 |
| 2.1.2 主要仪器 | 第20-21页 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 | 第21页 |
| 2.2 MSG1基因的克隆 | 第21-24页 |
| 2.2.1 DNA的提取 | 第21页 |
| 2.2.2 引物的设计与处理 | 第21页 |
| 2.2.3 PCR反应体系与条件 | 第21-22页 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测 | 第22页 |
| 2.2.5 目的条带回收纯化 | 第22-23页 |
| 2.2.6 目的条带连接 | 第23页 |
| 2.2.7 连接产物的扩增 | 第23-24页 |
| 2.2.8 质粒提取与测序 | 第24页 |
| 2.3 MSG1蛋白质的生物信息学分析 | 第24-25页 |
| 2.3.1 MSG1蛋白质的理化性质分析 | 第24-25页 |
| 2.3.2 MSG1蛋白质的信号肽分析 | 第25页 |
| 2.3.3 MSG1蛋白质的跨膜区分析 | 第25页 |
| 2.3.4 MSG1蛋白质表达水平的分析 | 第25页 |
| 2.4 结果与分析 | 第25-27页 |
| 2.4.1 MSG1基因的克隆 | 第25页 |
| 2.4.2 目的基因的鉴定 | 第25-26页 |
| 2.4.3 MSG1蛋白质的基本性质 | 第26页 |
| 2.4.4 信号肽分析 | 第26页 |
| 2.4.5 跨膜区分析 | 第26-27页 |
| 2.4.6 蛋白质表达水平分析 | 第27页 |
| 2.4.7 密码子优化 | 第27页 |
| 2.5 讨论 | 第27-29页 |
| 第三章 MSG1蛋白质的原核表达及pVAX1-MSG1核酸疫苗的制备 | 第29-47页 |
| 3.1 试验材料与仪器 | 第29-30页 |
| 3.1.1 试验材料 | 第29页 |
| 3.1.2 试验仪器 | 第29-30页 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 | 第30页 |
| 3.2 MSG1蛋白质原核表达载体的构建 | 第30-33页 |
| 3.2.1 目的基因的扩增 | 第30-31页 |
| 3.2.2 目的基因的酶切 | 第31页 |
| 3.2.3 目的基因的纯化 | 第31-32页 |
| 3.2.4 原核表达载体的酶切与纯化 | 第32页 |
| 3.2.5 目的基因与载体的连接 | 第32-33页 |
| 3.2.6 连接产物的扩增 | 第33页 |
| 3.2.7 原核表达质粒的提取与测序 | 第33页 |
| 3.3 MSG1蛋白质的原核表达 | 第33-35页 |
| 3.3.1 不同浓度的IPTG诱导表达 | 第33页 |
| 3.3.2 SDS-PAGE检测总蛋白的表达 | 第33-34页 |
| 3.3.3 WesternBlot鉴定表达的蛋白质 | 第34页 |
| 3.3.4 蛋白质的可溶性分析 | 第34-35页 |
| 3.3.5 IPTG诱导时间的确定 | 第35页 |
| 3.4 MSG1蛋白质的纯化 | 第35-37页 |
| 3.4.1 表达菌株的扩增与收集 | 第35-36页 |
| 3.4.2 细菌的裂解 | 第36页 |
| 3.4.3 纯化目的蛋白最佳条件的确定 | 第36-37页 |
| 3.4.4 目的蛋白透析除盐与验证 | 第37页 |
| 3.5 真核表达载体的构建 | 第37-38页 |
| 3.5.1 目的基因扩增 | 第37页 |
| 3.5.2 目的基因的酶切与纯化 | 第37-38页 |
| 3.5.3 pVAX1真核载体的酶切与纯化 | 第38页 |
| 3.5.4 目的基因与真核载体的连接 | 第38页 |
| 3.5.5 连接产物的扩增 | 第38页 |
| 3.5.6 真核表达质粒的提取与测序 | 第38页 |
| 3.6 pVAX1-MSG1核酸疫苗的大量制备 | 第38-40页 |
| 3.6.1 克隆菌株的扩增 | 第38-39页 |
| 3.6.2 质粒的大量提取 | 第39页 |
| 3.6.3 质粒的浓缩 | 第39-40页 |
| 3.6.4 核酸疫苗纯度检测及测序验证 | 第40页 |
| 3.7 结果与分析 | 第40-44页 |
| 3.7.1 原核表达载体的构建 | 第40页 |
| 3.7.2 IPTG诱导浓度的确定 | 第40-41页 |
| 3.7.3 WesternBlot鉴定表达的蛋白质 | 第41页 |
| 3.7.4 可溶性分析 | 第41-42页 |
| 3.7.5 IPTG诱导时间的确定 | 第42页 |
| 3.7.6 目的蛋白的纯化 | 第42-43页 |
| 3.7.7 目的蛋白的透析与鉴定 | 第43-44页 |
| 3.7.8 真核表达载体的构建 | 第44页 |
| 3.7.9 核酸疫苗的鉴定与纯度检测 | 第44页 |
| 3.8 讨论 | 第44-47页 |
| 第四章 MSG1重组蛋白及核酸疫苗联合免疫对机体生化指标的影响及免疫效果的评价 | 第47-62页 |
| 4.1 试验材料与仪器 | 第47-48页 |
| 4.1.1 试验材料 | 第47页 |
| 4.1.2 试验仪器 | 第47-48页 |
| 4.1.3 主要试剂的配制 | 第48页 |
| 4.2 小鼠免疫程序与样品收集 | 第48-49页 |
| 4.2.1 蛋白质浓度测定 | 第48页 |
| 4.2.2 小鼠的免疫 | 第48-49页 |
| 4.2.3 血清的收集 | 第49页 |
| 4.3 机体生化指标的测定 | 第49-50页 |
| 4.3.1 超氧化物歧化酶(SOD)的测定 | 第49-50页 |
| 4.3.2 丙二醛(MDA)的测定 | 第50页 |
| 4.3.3 生化指标的测定 | 第50页 |
| 4.4 细胞免疫效果的评价 | 第50-51页 |
| 4.4.1 测定前预处理 | 第50-51页 |
| 4.4.2 细胞因子白介素2的测定 | 第51页 |
| 4.5 酶联免疫吸附法评价体液免疫的水平 | 第51-53页 |
| 4.5.1 包被与封闭条件的确定 | 第51-52页 |
| 4.5.2 血清与二抗稀释度的确定 | 第52页 |
| 4.5.3 血清与二抗反应时间的确定 | 第52页 |
| 4.5.4 显色时间的确定 | 第52-53页 |
| 4.5.5 检测样品的抗体水平 | 第53页 |
| 4.6 结果与分析 | 第53-58页 |
| 4.6.1 超氧化物歧化酶的测定 | 第53-54页 |
| 4.6.2 丙二醛的测定 | 第54页 |
| 4.6.3 生化指标的测定 | 第54-55页 |
| 4.6.4 细胞因子白介素2的测定 | 第55-56页 |
| 4.6.5 包被与封闭条件的确定 | 第56页 |
| 4.6.6 血清与二抗稀释度的确定 | 第56-57页 |
| 4.6.7 血清与二抗反应时间的确定 | 第57页 |
| 4.6.8 显色时间的确定 | 第57页 |
| 4.6.9 抗体水平检测 | 第57-58页 |
| 4.7 讨论 | 第58-61页 |
| 4.8 全文创新点与小结 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-70页 |
| 附录I | 第70-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
| 作者简介 | 第72页 |
