| 摘要 | 第3-5页 |
| abstract | 第5-6页 |
| 缩略词 | 第7-13页 |
| 第一部分 文献综述 | 第13-23页 |
| 引言 | 第13页 |
| 1、甜瓜病毒病研究进展 | 第13-16页 |
| 1.1 新疆甜瓜病毒病的主要类型及分布 | 第13页 |
| 1.2 甜瓜病毒病的传播途径和防治 | 第13-14页 |
| 1.3 病毒病相关的基因抗病性研究 | 第14-15页 |
| 1.4 eIF4E基因研究进展 | 第15-16页 |
| 2、甜瓜白粉病研究进展 | 第16-18页 |
| 2.1 新疆甜瓜白粉病的主要类型及分布 | 第16页 |
| 2.2 甜瓜白粉病的传播途径和防治 | 第16-17页 |
| 2.3 白粉病相关基因抗性研究 | 第17页 |
| 2.4 MLO基因研究进展 | 第17-18页 |
| 3、基因组编辑技术 | 第18-21页 |
| 3.1 锌指核酸酶(ZFN) | 第18-19页 |
| 3.2 类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN) | 第19-20页 |
| 3.3 成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR/Cas9) | 第20-21页 |
| 4、本文研究目的与意义 | 第21-23页 |
| 第二部分 实验部分 | 第23-69页 |
| 第一章 eIF4E和MLO基因的功能分析 | 第23-29页 |
| 1、材料 | 第23页 |
| 1.1 主要材料 | 第23页 |
| 1.2 主要试剂 | 第23页 |
| 2、方法 | 第23-25页 |
| 2.1 植物总RNA的提取 | 第24页 |
| 2.2 甜瓜cDNA合成 | 第24-25页 |
| 2.3 甜瓜eIF4E和MLO基因引物设计及目的条带的扩增 | 第25页 |
| 3、结果与分析 | 第25-27页 |
| 3.1 植物总RNA的提取质量 | 第25-26页 |
| 3.2 eIF4E和MLO基因表达差异分析 | 第26-27页 |
| 4、讨论 | 第27-29页 |
| 第二章 CRISPR-Cas9植物基因敲除载体的构建 | 第29-47页 |
| 1、材料 | 第29-30页 |
| 1.1 主要材料 | 第29页 |
| 1.1.1 植物材料 | 第29页 |
| 1.1.2 菌株与质粒 | 第29页 |
| 1.2 主要试剂 | 第29-30页 |
| 1.2.1 酶和生化试剂 | 第29页 |
| 1.2.2 激素的配制 | 第29-30页 |
| 1.3 主要仪器 | 第30页 |
| 2、方法 | 第30-38页 |
| 2.1 eIF4E和MLO基因靶序列扩增与比对 | 第30-32页 |
| 2.1.1 植物总DNA的提取 | 第30-31页 |
| 2.1.2 靶序列的扩增 | 第31-32页 |
| 2.1.3 靶位点序列测序比对 | 第32页 |
| 2.2 甜瓜eIF4E和MLO基因敲除靶点选择及gRNA引物设计 | 第32页 |
| 2.3 sgRNA克隆框的构建 | 第32-33页 |
| 2.4 线性化载体制备 | 第33页 |
| 2.5 构建重组表达载体pP1C.4-eIF4E和pP1C.4-MLO | 第33-34页 |
| 2.6 重组质粒的转化 | 第34-35页 |
| 2.7 阳性克隆的筛选及测序 | 第35页 |
| 2.8 农杆菌的转化 | 第35-38页 |
| 2.8.1 重组质粒的提取 | 第35-36页 |
| 2.8.2 农杆菌感受态的制备 | 第36-37页 |
| 2.8.3 冻融法转化根癌农杆菌 | 第37页 |
| 2.8.4 菌落PCR验证 | 第37-38页 |
| 3、结果与分析 | 第38-45页 |
| 3.1 eIF4E和MLO基因靶序列扩增与比对 | 第38-40页 |
| 3.1.1 靶序列的扩增 | 第38页 |
| 3.1.2 靶序列比对 | 第38-40页 |
| 3.2 sgRNA靶点序列选择及引物设计 | 第40-41页 |
| 3.2.1 甜瓜eIF4E基因的sgRNA靶点序列选择及引物设计 | 第40页 |
| 3.2.2 甜瓜MLO基因的sgRNA靶点序列选择及引物设计 | 第40-41页 |
| 3.3 sgRNA克隆框的构建 | 第41-42页 |
| 3.4 线性化载体的获得 | 第42-43页 |
| 3.5 重组表达载体的检测 | 第43-44页 |
| 3.6 重组表达载体的测序验证 | 第44-45页 |
| 3.7 转化农杆菌阳性检测 | 第45页 |
| 4、讨论 | 第45-47页 |
| 第三章 “皇后”再生体系优化及抗生素浓度筛选 | 第47-58页 |
| 1、材料 | 第47-48页 |
| 1.1 主要材料 | 第47页 |
| 1.2 主要试剂 | 第47页 |
| 1.3 主要仪器 | 第47-48页 |
| 2、方法 | 第48-49页 |
| 2.1 甜瓜种子消毒处理及外植体的获得 | 第48页 |
| 2.2 IAA和6-BA的最适浓度的确定 | 第48页 |
| 2.3 潮霉素选择压的确定 | 第48页 |
| 2.4 头孢噻肟钠抑菌浓度的确定 | 第48-49页 |
| 2.4.1 探索头孢霉素对农杆菌的最佳抑制浓度 | 第48-49页 |
| 2.4.2 探索头孢噻肟钠对外植体生长的影响 | 第49页 |
| 3、结果与分析 | 第49-56页 |
| 3.1 IAA和6-BA对外植体出芽率的影响 | 第49-51页 |
| 3.2 潮霉素选择压的确定 | 第51-53页 |
| 3.3 头孢噻肟钠抑菌浓度的确定 | 第53-56页 |
| 3.3.1 头孢噻肟钠对农杆菌的抑制情况 | 第53-54页 |
| 3.3.2 头孢噻肟钠对外植体的影响 | 第54-56页 |
| 4、讨论 | 第56-58页 |
| 第四章 EIF4E和MLO基因敲除载体的遗传转化及分析 | 第58-69页 |
| 1、材料 | 第58-60页 |
| 1.1 主要材料 | 第58页 |
| 1.1.1 植物材料 | 第58页 |
| 1.1.2 菌株与质粒 | 第58页 |
| 1.2 主要激素及培养基 | 第58-60页 |
| 1.3 主要仪器 | 第60页 |
| 2、方法 | 第60-63页 |
| 2.1 农杆菌介导甜瓜的遗传转化 | 第60-61页 |
| 2.1.1 甜瓜种子消毒处理及外植体的获得 | 第60页 |
| 2.1.2 外植体预培养 | 第60页 |
| 2.1.3 农杆菌浸染及共培养 | 第60页 |
| 2.1.4 外植体的筛选培养以及不定芽的伸长 | 第60-61页 |
| 2.2 阳性植株的检测鉴定 | 第61-63页 |
| 2.2.1 转化甜瓜基因组DNA提取 | 第61-62页 |
| 2.2.2 抗潮霉素基因及靶位点序列PCR检测 | 第62页 |
| 2.2.3 靶位点序列PCR检测 | 第62-63页 |
| 2.2.4 靶位点序列测序比对 | 第63页 |
| 3、结果与分析 | 第63-67页 |
| 3.1 农杆菌介导甜瓜的遗传转化 | 第63-64页 |
| 3.2 阳性植株的检测鉴定 | 第64-67页 |
| 3.2.1 转化甜瓜基因组DNA提取 | 第64-65页 |
| 3.2.2 抗潮霉素基因及靶位点序列PCR检测 | 第65-66页 |
| 3.2.3 靶位点序列测序比对 | 第66-67页 |
| 4、讨论 | 第67-69页 |
| 第三部分 结论 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-78页 |
| 致谢 | 第78-79页 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 | 第79-80页 |
