| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 文献综述 | 第15-49页 |
| 第一章 基因打靶技术在转基因家畜研究中的应用 | 第15-32页 |
| 1.1 转基因动物研究进展 | 第15-17页 |
| 1.2 体细胞基因打靶 | 第17-27页 |
| 1.2.1 打靶载体的同源臂设计 | 第17-23页 |
| 1.2.2 基因打靶载体的传递方法 | 第23-24页 |
| 1.2.3 基因打靶筛选策略 | 第24-25页 |
| 1.2.4 基因组位置效应的影响 | 第25页 |
| 1.2.5 原代细胞及其培养条件 | 第25-27页 |
| 1.3 提高同源重组效率的策略 | 第27-32页 |
| 1.3.1 利用ZFNs生产基因敲除家畜 | 第28-29页 |
| 1.3.2 TALENs在家畜细胞和胚胎中的应用 | 第29-30页 |
| 1.3.3 评估位点特异性核酸酶脱靶活性的风险 | 第30-32页 |
| 第二章 锌指核酸酶在动物遗传修饰中的应用 | 第32-49页 |
| 2.1 锌指的结构 | 第32页 |
| 2.2 锌指核酸酶(ZFNs)的发明 | 第32-34页 |
| 2.3 锌指核酸酶介导的基因组修饰 | 第34-36页 |
| 2.4 锌指核酸酶的设计 | 第36-37页 |
| 2.5 锌指核酸酶介导的脱靶位点(OTS)突变 | 第37-43页 |
| 2.6 锌指核酸酶介导的基因打靶在不同生物体中的应用 | 第43-49页 |
| 2.6.1 锌指核酸酶在哺乳动物和多能细胞中的应用 | 第43-45页 |
| 2.6.2 锌指核酸酶在模式生物中的应用 | 第45-46页 |
| 2.6.3 锌指核酸酶在实验动物中的应用 | 第46-47页 |
| 2.6.4 锌指核酸酶在大动物模型中的应用 | 第47-49页 |
| 试验研究 | 第49-126页 |
| 第三章 锌指核酸酶在牛胎儿成纤维细胞中的活性检测分析 | 第49-69页 |
| 3.1 材料和试剂 | 第50页 |
| 3.1.1 材料 | 第50页 |
| 3.1.2 试剂 | 第50页 |
| 3.2 方法 | 第50-59页 |
| 3.2.1 荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞的培养 | 第50-51页 |
| 3.2.2 锌指核酸酶表达质粒的制备 | 第51-53页 |
| 3.2.3 锌指核酸酶表达质粒转染牛胎儿成纤维细胞 | 第53-54页 |
| 3.2.4 CEL-I分析锌指核酸酶切割活性 | 第54-56页 |
| 3.2.5 测序分析锌指核酸酶切割活性 | 第56-57页 |
| 3.2.6 锌指核酸酶改造 | 第57-58页 |
| 3.2.7 锌指豁口酶切割活性分析 | 第58-59页 |
| 3.3 结果 | 第59-67页 |
| 3.3.1 荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞原代培养及胎儿性别鉴定 | 第59-60页 |
| 3.3.2 锌指核酸酶表达质粒及酶切结果 | 第60页 |
| 3.3.3 牛胎儿成纤维细胞转染锌指核酸酶表达质粒结果 | 第60-61页 |
| 3.3.4 CEL-I分析锌指核酸酶切割活性结果 | 第61-63页 |
| 3.3.5 测序分析锌指核酸酶切割活性结果 | 第63-65页 |
| 3.3.6 锌指核酸酶改造结果 | 第65页 |
| 3.3.7 锌指豁口酶切割活性分析结果 | 第65-67页 |
| 3.4 讨论 | 第67-68页 |
| 3.5 小结 | 第68-69页 |
| 第四章 基因打靶载体的构建及在牛乳腺上皮细胞中的验证分析 | 第69-89页 |
| 4.1 材料和试剂 | 第69-70页 |
| 4.1.1 材料 | 第69页 |
| 4.1.2 试剂 | 第69-70页 |
| 4.2 方法 | 第70-76页 |
| 4.2.1 牛乳腺上皮细胞的分离培养 | 第70页 |
| 4.2.2 牛β-酪蛋白位点基因打靶载体的构建 | 第70-74页 |
| 4.2.3 打靶载体元件在牛乳腺上皮细胞中的功能验证 | 第74-76页 |
| 4.3 结果 | 第76-87页 |
| 4.3.1 牛乳腺上皮细胞原代培养结果 | 第76-77页 |
| 4.3.2 牛β-酪蛋白位点基因打靶载体的构建结果 | 第77-83页 |
| 4.3.3 打靶载体在牛乳腺上皮细胞中的功能验证结果 | 第83-87页 |
| 4.4 讨论 | 第87-88页 |
| 4.5 小结 | 第88-89页 |
| 第五章 利用锌指核酸酶生产转基因牛胎儿成纤维细胞 | 第89-105页 |
| 5.1 材料与方法 | 第90页 |
| 5.1.1 材料 | 第90页 |
| 5.1.2 试剂 | 第90页 |
| 5.2 方法 | 第90-93页 |
| 5.2.1 转染质粒的制备 | 第90页 |
| 5.2.2 牛胎儿成纤维细胞的培养 | 第90-91页 |
| 5.2.3 细胞转染及筛选 | 第91-92页 |
| 5.2.4 细胞单克隆的PCR鉴定 | 第92页 |
| 5.2.5 Southern Blot探针制备 | 第92-93页 |
| 5.2.6 中靶细胞的Southern Blot鉴定 | 第93页 |
| 5.3 结果 | 第93-103页 |
| 5.3.1 锌指核酸酶诱导人溶菌酶基因定点整合插入到牛胎儿成纤维细胞CSN2位点 | 第93-100页 |
| 5.3.2 锌指豁口酶诱导溶葡萄球菌素基因定点整合插入到牛胎儿成纤维细胞CSN2位点 | 第100-103页 |
| 5.4 讨论 | 第103-104页 |
| 5.5 小结 | 第104-105页 |
| 第六章 通过SCNT生产体细胞基因打靶克隆牛 | 第105-126页 |
| 6.1 材料与试剂 | 第105-106页 |
| 6.1.1 材料 | 第105页 |
| 6.1.2 试剂 | 第105-106页 |
| 6.2 方法 | 第106-108页 |
| 6.2.1 卵母细胞的采集,成熟培养和去核 | 第106页 |
| 6.2.2 转基因细胞的准备 | 第106页 |
| 6.2.3 转基因克隆胚的获得 | 第106页 |
| 6.2.4 转基因克隆胚的PCR检测 | 第106页 |
| 6.2.5 转基因克隆胚的胚胎移植和妊娠鉴定 | 第106-107页 |
| 6.2.6 转基因克隆牛的PCR鉴定 | 第107页 |
| 6.2.7 转基因克隆牛的Southern Blot鉴定 | 第107页 |
| 6.2.8 转基因克隆牛乳汁采集和成分分析 | 第107页 |
| 6.2.9 转基因克隆牛乳汁的体外抗菌活性检测 | 第107页 |
| 6.2.10 转基因克隆牛的攻菌试验 | 第107-108页 |
| 6.2.11 数据统计 | 第108页 |
| 6.3 结果 | 第108-123页 |
| 6.3.1 体细胞核移植生产转基因克隆牛结果 | 第108-111页 |
| 6.3.2 转基因克隆胚的鉴定结果 | 第111-112页 |
| 6.3.3 转基因克隆牛的PCR检测结果 | 第112-115页 |
| 6.3.4 转基因克隆牛的Southern Blot检测结果 | 第115-117页 |
| 6.3.5 转基因克隆牛乳汁成分分析结果 | 第117-120页 |
| 6.3.6 转基因克隆牛乳汁体外抑菌试验分析结果 | 第120-122页 |
| 6.3.7 转人溶菌酶基因克隆牛攻菌试验结果 | 第122-123页 |
| 6.4 讨论 | 第123-125页 |
| 6.5 小结 | 第125-126页 |
| 全文总结 | 第126-127页 |
| 创新之处和进一步研究的课题 | 第127-128页 |
| 参考文献 | 第128-144页 |
| 附录 | 第144-151页 |
| 致谢 | 第151-152页 |
| 个人简介 | 第152页 |
