| 摘要 | 第7-11页 |
| ABSTRACT | 第11-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-45页 |
| 1.1 链霉菌简介 | 第19-20页 |
| 1.2 链霉菌中复杂的次级代谢调控 | 第20-34页 |
| 1.2.1 传导胞外信息的荷尔蒙类调控因子 | 第21-27页 |
| 1.2.2 抗生素生物合成复杂的级联调控网络 | 第27-31页 |
| 1.2.3 末端产物的自我反馈调控 | 第31-32页 |
| 1.2.4 N-乙酰葡萄糖胺的调控 | 第32-33页 |
| 1.2.5 TTA 稀有密码子的调控 | 第33-34页 |
| 1.3 多角度的链霉菌代谢工程育种策略 | 第34-40页 |
| 1.3.1 OSMAC 策略 | 第35-36页 |
| 1.3.2 共培养同一生境微生物 | 第36-37页 |
| 1.3.3 核糖体工程与细胞的 ppGpp 严谨反应 | 第37-38页 |
| 1.3.4 逆向工程及基因组重组育种 | 第38-39页 |
| 1.3.5 转录组筛选 | 第39页 |
| 1.3.6 异源表达 | 第39-40页 |
| 1.4 核苷类抗生素生物合成调控的研究进展 | 第40-43页 |
| 1.5 本课题研究的理论依据、目的以及意义 | 第43-45页 |
| 第二章 材料与方法 | 第45-81页 |
| 2.1 实验材料 | 第45-58页 |
| 2.1.1 菌株 | 第45-46页 |
| 2.1.2 质粒 | 第46-48页 |
| 2.1.3 寡核苷酸引物以及序列 | 第48-52页 |
| 2.1.4 培养基及其配方 | 第52-54页 |
| 2.1.5 试剂等 | 第54-57页 |
| 2.1.6 抗生素及其使用浓度 | 第57-58页 |
| 2.2 实验方法 | 第58-81页 |
| 2.1.1 菌种保藏 | 第58页 |
| 2.2.2 质粒 DNA 的提取 | 第58页 |
| 2.2.3 链霉菌总 DNA 的少量快速提取 | 第58-59页 |
| 2.2.4 Omega 试剂盒用于回收 DNA 片段 | 第59页 |
| 2.2.5 CaCl_2法感受态的制备与环状 DNA 的转化 | 第59页 |
| 2.2.6 电转感受态的制备与线状 DNA 的电转化 | 第59-60页 |
| 2.2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第60-61页 |
| 2.2.8 接合转移 | 第61-62页 |
| 2.2.9 基因突变菌株的构建、筛选以及验证 | 第62-63页 |
| 2.2.10 Muraymycin 产生菌发酵液的生物活性测定 | 第63-64页 |
| 2.2.11 Muraymycin 的发酵产生和分离提取 | 第64页 |
| 2.2.12 Muraymycin 产生菌发酵产物的 LC-MS 检测 | 第64-65页 |
| 2.2.13 链霉菌总 RNA 的提取以及 DNase I 消化 | 第65-66页 |
| 2.2.14 全细胞 RNA 的逆转录 | 第66-67页 |
| 2.2.15 实时荧光定量 PCR | 第67-68页 |
| 2.2.16 快速扩增 cDNA 末端 | 第68-72页 |
| 2.2.17 核酸序列的定点突变 | 第72-73页 |
| 2.2.18 链霉菌全蛋白粗提物制备以及儿茶酚-2,3-双加氧酶活性测定 | 第73页 |
| 2.2.19 融合蛋白的表达与纯化 | 第73-74页 |
| 2.2.20 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE） | 第74-75页 |
| 2.2.21 凝胶阻滞试验 | 第75-76页 |
| 2.2.22 DNase I 足迹试验 | 第76-79页 |
| 2.2.23 蛋白质的体外交联试验 | 第79-80页 |
| 2.2.24 生物信息学分析 | 第80-81页 |
| 第三章 Muraymycin 基因簇的异源表达以及边界测定 | 第81-92页 |
| 3.1 前言 | 第81页 |
| 3.2 Muraymycin 基因簇在 S. lividans TK24 宿主菌中的异源表达 | 第81-82页 |
| 3.3 Muraymycin 基因簇中调控基因的生物信息学分析 | 第82-85页 |
| 3.4 构建 mur34 在 18F3 上的突变、突变株发酵液的生物活性测定以及产物的LC-MS 检测分析 | 第85-87页 |
| 3.5 构建 Muraymycin 基因簇边界基因的突变、突变株发酵液的抑菌活性测定以及抗生素产物的 LC-MS 检测 | 第87-90页 |
| 3.6 小结与讨论 | 第90-92页 |
| 第四章 Muraymycin 基因簇中 mur34 的调控功能 | 第92-117页 |
| 4.1 Muraymycin 基因簇中 mur34 的遗传功能 | 第92-100页 |
| 4.1.1 前言 | 第92页 |
| 4.1.2 基因组中 mur34 突变的构建、突变株发酵液的抑菌活性以及抗生素产物的 LC-MS 检测 | 第92-94页 |
| 4.1.3 mur34 突变株的回补 | 第94-95页 |
| 4.1.4 Muraymycin 基因簇中基因转录单元的测定 | 第95-97页 |
| 4.1.5 mur34 突变株中 muraymycin 基因簇的转录表达 | 第97-99页 |
| 4.1.6 小结与讨论 | 第99-100页 |
| 4.2 Mur34 的体外功能 | 第100-111页 |
| 4.2.1 前言 | 第100页 |
| 4.2.2 Mur34 融合蛋白的表达与分离纯化 | 第100-102页 |
| 4.2.3 Mur34 与启动子 DNA 的体外结合 | 第102-103页 |
| 4.2.4 Mur34 与 mur33-mur32 启动子 DNA 的体外结合 | 第103-106页 |
| 4.2.5 Mur34 在启动子上的结合位点分析 | 第106-109页 |
| 4.2.6 Mur34 的 EGS 交联试验 | 第109-111页 |
| 4.2.7 小结与讨论 | 第111页 |
| 4.3 mur33-mur32 的启动子活性 | 第111-115页 |
| 4.3.1 前言 | 第111-112页 |
| 4.3.2 启动子活性区序列的选择以及-10 和-35 区的缺失突变 | 第112页 |
| 4.3.3 启动子报告载体的构建以及活性测定 | 第112-115页 |
| 4.3.4 小结与讨论 | 第115页 |
| 4.4 本章小结 | 第115-117页 |
| 第五章 Muraymycin 基因簇中 mur33 和 mur32 的遗传功能 | 第117-139页 |
| 5.1 Muraymycin 基因簇中 mur33 的遗传功能 | 第117-122页 |
| 5.1.1 前言 | 第117页 |
| 5.1.2 基因组中 mur33 突变的构建、突变株发酵液的抑菌活性以及抗生素产物的 LC-MS 检测 | 第117-119页 |
| 5.1.3 mur33 突变株的回补 | 第119-120页 |
| 5.1.4 mur33 突变株中 muraymycin 基因簇的转录表达 | 第120-121页 |
| 5.1.5 小结与讨论 | 第121-122页 |
| 5.2 Mur33 与菌体生长 | 第122-128页 |
| 5.2.1 前言 | 第122页 |
| 5.2.2 Muraymycin 产生菌各菌株生长曲线的测定 | 第122-123页 |
| 5.2.3 mur33 多拷贝菌株的生长以及产孢 | 第123-125页 |
| 5.2.4 Mur33 表达载体的构建以及 TTA 密码子的突变 | 第125页 |
| 5.2.5 Mur33 对异源宿主生长的影响 | 第125-127页 |
| 5.2.6 小结与讨论 | 第127-128页 |
| 5.3 Mur33 的体外功能 | 第128-133页 |
| 5.3.1 前言 | 第128页 |
| 5.3.2 Mur33 表达载体的构建以及融合蛋白的表达 | 第128-130页 |
| 5.3.3 Mur33 与启动子 DNA 的体外结合 | 第130-133页 |
| 5.3.4 小结与讨论 | 第133页 |
| 5.4 Muraymycin 基因簇中 mur32 的遗传功能 | 第133-137页 |
| 5.4.1 前言 | 第133-134页 |
| 5.4.2 基因组中 mur32 突变的构建、突变株发酵液的活性检测以及抗生素产物的 LC-MS 检测分析 | 第134-136页 |
| 5.4.3 mur32 突变株中 muraymycin 基因簇的转录表达 | 第136-137页 |
| 5.4.4 小结与讨论 | 第137页 |
| 5.5 本章小结 | 第137-139页 |
| 第六章 总结与展望 | 第139-142页 |
| 6.1 工作总结和主要创新点 | 第139-140页 |
| 6.2 工作展望 | 第140-142页 |
| 参考文献 | 第142-153页 |
| 致谢 | 第153-155页 |
| 攻读学位期间发表或已录用的学术论文 | 第155页 |
