| 中文摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 引言 | 第12-23页 |
| 1.1 几丁质概述 | 第12-14页 |
| 1.1.1 几丁质的来源、性质及结构 | 第12-13页 |
| 1.1.2 几丁质降解产物的研究与应用 | 第13-14页 |
| 1.2 几丁质酶概述 | 第14-19页 |
| 1.2.1 微生物几丁质酶的来源 | 第14-15页 |
| 1.2.2 微生物几丁质酶的性质 | 第15-16页 |
| 1.2.3 几丁质酶分子生物学研究 | 第16-19页 |
| 1.2.3.1 几丁质酶结构 | 第17-18页 |
| 1.2.3.2 几丁质酶的克隆表达 | 第18-19页 |
| 1.3 几丁质酶的应用 | 第19-21页 |
| 1.3.1 生产几丁寡糖 | 第19-20页 |
| 1.3.2 植物病虫生物防治 | 第20页 |
| 1.3.3 植物抗病基因工程 | 第20-21页 |
| 1.4 本课题的选题依据与研究内容 | 第21-23页 |
| 1.4.1 选题依据 | 第21页 |
| 1.4.2 研究内容 | 第21-23页 |
| 第二章 产几丁质酶微生物的筛选及资源库建设 | 第23-44页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-26页 |
| 2.1.1 样品来源 | 第23页 |
| 2.1.2 菌株和质粒 | 第23页 |
| 2.1.3 试剂和仪器 | 第23-24页 |
| 2.1.3.1 试剂 | 第23-24页 |
| 2.1.3.2 主要仪器设备 | 第24页 |
| 2.1.4 培养基 | 第24-25页 |
| 2.1.5 常用试剂的配制 | 第25-26页 |
| 2.2 实验方法 | 第26-33页 |
| 2.2.1 样品的处理及产几丁质酶微生物的筛选 | 第26页 |
| 2.2.1.1 产几丁质酶微生物的初筛 | 第26页 |
| 2.2.1.2 产几丁质酶微生物的复筛 | 第26页 |
| 2.2.2 几丁质酶初步纯化和浓缩 | 第26-27页 |
| 2.2.2.1 硫酸铵分级沉淀 | 第26-27页 |
| 2.2.2.2 透析 | 第27页 |
| 2.2.2.3 PEG2000浓缩 | 第27页 |
| 2.2.3 几丁质酶活力测定 | 第27-30页 |
| 2.2.3.1 N-乙酰-D-氨基葡萄糖标准曲线绘制 | 第27-28页 |
| 2.2.3.2 几丁质酶活力测定 | 第28-29页 |
| 2.2.3.3 酶活力计算 | 第29页 |
| 2.2.3.4 不同pH对几丁质酶活力的影响 | 第29页 |
| 2.2.3.5 不同温度对几丁质酶活力的影响 | 第29页 |
| 2.2.3.6 pH稳定性试验 | 第29-30页 |
| 2.2.3.7 热稳定性试验 | 第30页 |
| 2.2.4 菌株的鉴定 | 第30-33页 |
| 2.2.4.1 基因组DNA的提取 | 第30页 |
| 2.2.4.2 16S和ITS rDNA的PCR扩增 | 第30-31页 |
| 2.2.4.3 PCR扩增产物的回收与纯化 | 第31页 |
| 2.2.4.4 DNA片段的连接和转化 | 第31-32页 |
| 2.2.4.5 阳性重组子的筛选及DNA测序 | 第32-33页 |
| 2.3 结果与分析 | 第33-42页 |
| 2.3.1 产几丁质酶菌株的筛选及鉴定 | 第33-37页 |
| 2.3.2 几丁质酶酶学性质研究 | 第37-39页 |
| 2.3.3 GR-52菌株分子生物学鉴定 | 第39-42页 |
| 2.4 小结 | 第42-44页 |
| 第三章 分离菌的几丁质酶基因片段的扩增 | 第44-57页 |
| 3.1 实验材料 | 第44-45页 |
| 3.1.1 菌株来源 | 第44页 |
| 3.1.2 克隆菌株和质粒 | 第44页 |
| 3.1.3 试剂和仪器 | 第44页 |
| 3.1.3.1 试剂 | 第44页 |
| 3.1.3.2 主要仪器设备 | 第44页 |
| 3.1.4 培养基 | 第44页 |
| 3.1.5 引物合成与DNA测序 | 第44-45页 |
| 3.1.6 常用溶液 | 第45页 |
| 3.2 实验方法 | 第45-47页 |
| 3.2.1 基因组的提取 | 第45页 |
| 3.2.2 基因保守区简并引物的设计 | 第45-46页 |
| 3.2.2.1 第18家族(GH18)几丁质酶基因简并引物的设计 | 第45-46页 |
| 3.2.2.2 第19家族(GH19)几丁质酶基因简并引物的设计 | 第46页 |
| 3.2.3 几丁质酶基因片段的PCR扩增 | 第46-47页 |
| 3.2.4 PCR扩增产物的回收与纯化 | 第47页 |
| 3.2.5 DNA片段的连接和转化 | 第47页 |
| 3.2.6 阳性重组子的筛选及DNA测序 | 第47页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第47-56页 |
| 3.3.1 简并引物设计 | 第47-51页 |
| 3.3.1.1 第18家族几丁质酶简并引物设计 | 第47-50页 |
| 3.3.1.2 第19家族几丁质酶简并引物设计 | 第50-51页 |
| 3.3.2 几丁质酶基因片段的扩增 | 第51-56页 |
| 3.4 小结 | 第56-57页 |
| 第四章 几丁质酶基因chiGR52-1和chiGR52-2的克隆及全长序列分析 | 第57-73页 |
| 4.1 实验材料 | 第57-58页 |
| 4.1.1 菌株来源 | 第57页 |
| 4.1.2 菌株和质粒 | 第57页 |
| 4.1.3 试剂和仪器 | 第57-58页 |
| 4.1.3.1 试剂 | 第57-58页 |
| 4.1.3.2 主要仪器设备 | 第58页 |
| 4.1.4 培养基 | 第58页 |
| 4.1.5 常用溶液 | 第58页 |
| 4.2 实验方法 | 第58-62页 |
| 4.2.1 基因全长序列的扩增 | 第58-62页 |
| 4.2.1.1 基因组DNA的提取 | 第58页 |
| 4.2.1.2 特异性引物(SP引物)及随机简并引物(AP引物)的设计 | 第58-59页 |
| 4.2.1.3 TAIL-PCR扩增基因全长 | 第59-61页 |
| 4.2.1.4 TAIL-PCR产物回收测序 | 第61-62页 |
| 4.2.2 几丁质酶序列的分析 | 第62页 |
| 4.3 结果与分析 | 第62-72页 |
| 4.3.1 TAIL-PCR扩增基因全长 | 第62-64页 |
| 4.3.1.1 chiGR52-1基因全长扩增 | 第62-63页 |
| 4.3.1.2 chiGR52-2基因全长扩增 | 第63-64页 |
| 4.3.2 几丁质酶全长序列分析 | 第64-72页 |
| 4.3.2.1 chiGR52-1基因全长序列分析 | 第64-68页 |
| 4.3.2.2 chiGR52-2基因全长序列分析 | 第68-72页 |
| 4.4 小结 | 第72-73页 |
| 第五章 chiGR52-1和chiGR52-2在大肠杆菌中表达及酶学性质研究 | 第73-95页 |
| 5.1 实验材料 | 第73-74页 |
| 5.1.1 菌株来源 | 第73页 |
| 5.1.2 菌株和质粒 | 第73页 |
| 5.1.3 试剂和仪器 | 第73-74页 |
| 5.1.3.1 试剂 | 第73-74页 |
| 5.1.3.2 主要仪器设备 | 第74页 |
| 5.1.4 培养基 | 第74页 |
| 5.1.5 常用溶液 | 第74页 |
| 5.2 实验方法 | 第74-81页 |
| 5.2.1 几丁质酶基因重组质粒的构建 | 第75-77页 |
| 5.2.1.1 几丁质酶基因的克隆 | 第75页 |
| 5.2.1.2 酶切与连接 | 第75-76页 |
| 5.2.1.3 重组质粒转化 | 第76页 |
| 5.2.1.4 阳性重组子的验证 | 第76-77页 |
| 5.2.1.5 重组质粒的提取 | 第77页 |
| 5.2.1.6 重组质粒转化表达宿主菌BL21(DE3) | 第77页 |
| 5.2.1.7 重组几丁质酶的诱导 | 第77页 |
| 5.2.2 重组酶的浓缩纯化 | 第77-79页 |
| 5.2.2.1 重组酶的大量诱导 | 第77-78页 |
| 5.2.2.2 重组酶中空纤维柱浓缩 | 第78页 |
| 5.2.2.3 重组酶镍柱纯化 | 第78页 |
| 5.2.2.4 重组酶的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第78-79页 |
| 5.2.3 重组酶的酶学性质研究 | 第79-81页 |
| 5.2.3.1 不同pH对几丁质酶活力的影响 | 第79页 |
| 5.2.3.2 不同温度对几丁质酶活力的影响 | 第79页 |
| 5.2.3.3 pH稳定性试验 | 第79-80页 |
| 5.2.3.4 热稳定性试验 | 第80页 |
| 5.2.3.5 不同金属离子及相关化学试剂对几丁质酶的影响 | 第80页 |
| 5.2.3.6 BCA法测定蛋白浓度 | 第80页 |
| 5.2.3.7 重组酶比活的测定 | 第80页 |
| 5.2.3.8 重组酶K_m值和V_(max)值的测定 | 第80-81页 |
| 5.2.3.9 重组酶底物特异性的测定 | 第81页 |
| 5.2.3.10 重组酶酶解几丁质产物分析 | 第81页 |
| 5.3 结果与分析 | 第81-93页 |
| 5.3.1 chiGR52-1在大肠杆菌中表达及及重组酶的纯化和性质研究 | 第81-88页 |
| 5.3.1.1 pET22b(+)-chiGR52-1重组质粒的构建 | 第81-82页 |
| 5.3.1.2 重组酶rChiGR52-1的表达纯化 | 第82-83页 |
| 5.3.1.3 重组酶rChiGR52-1最适pH和pH稳定性 | 第83-84页 |
| 5.3.1.4 重组酶rChiGR52-1最适反应温度和热稳定性 | 第84-85页 |
| 5.3.1.5 不同金属离子及化学试剂对重组酶rChiGR52-1的影响 | 第85页 |
| 5.3.1.6 重组酶rChiGR52-1 K_m值和V_(max)值的测定 | 第85-86页 |
| 5.3.1.7 重组酶rChiGR52-1的底物特异性 | 第86-87页 |
| 5.3.1.8 重组酶rChiGR52-1降解几丁质产物分析 | 第87-88页 |
| 5.3.2 chiGR52-2在大肠杆菌中表达及重组酶的纯化和性质研究 | 第88-93页 |
| 5.3.2.1 pET22b(+)-chiGR52-2的重组质粒的构建 | 第88页 |
| 5.3.2.2 rChiGR52-2的表达纯化 | 第88-89页 |
| 5.3.2.3 重组酶rChiGR52-2最适pH和温度 | 第89-90页 |
| 5.3.2.4 重组酶rChiGR52-2K_m值和V_(max)值的测定 | 第90-91页 |
| 5.3.2.5 重组酶rChiGR52-2的底物特异性 | 第91-92页 |
| 5.3.2.6 重组酶rChiGR52-2产物分析 | 第92-93页 |
| 5.4 小结 | 第93-95页 |
| 第七章 结论与展望 | 第95-98页 |
| 结论 | 第95-97页 |
| 展望 | 第97-98页 |
| 参考文献 | 第98-104页 |
| 致谢 | 第104-105页 |
| 个人简历 | 第105页 |
