| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 缩略词表 | 第9-10页 |
| 第一章 引言 | 第10-19页 |
| 1.1. 嗜肺军团菌(Legionella pneumophila) | 第10-13页 |
| 1.2. 磷酸酶(phosphatase) | 第13-17页 |
| 1.3. MapA (Legionella pneumophila major acid phosphates) | 第17-19页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第19-31页 |
| 2.1. 实验材料 | 第19-21页 |
| 2.1.1. 实验菌株和载体 | 第19页 |
| 2.1.2. 实验主要试剂 | 第19-20页 |
| 2.1.3. 实验仪器和设备 | 第20-21页 |
| 2.2. 克隆构建 | 第21-24页 |
| 2.2.1. PCR扩增目的片段 | 第21页 |
| 2.2.2. PCR产物和载体双酶切 | 第21-22页 |
| 2.2.3. 连接反应 | 第22页 |
| 2.2.4. 转化 | 第22页 |
| 2.2.5. 重组子检验 | 第22-23页 |
| 2.2.6. 突变体的构建 | 第23-24页 |
| 2.3. 蛋白表达纯化 | 第24-26页 |
| 2.3.1. 蛋白表达检验 | 第24页 |
| 2.3.2. 蛋白大量表达及收菌 | 第24-25页 |
| 2.3.3. 蛋白亲和层析纯化 | 第25页 |
| 2.3.4. 蛋白分子筛层析纯化 | 第25-26页 |
| 2.4. 蛋白晶体生长 | 第26-27页 |
| 2.4.1. 蛋白结晶原理及基本方法 | 第26页 |
| 2.4.2. 蛋白晶体条件初筛 | 第26-27页 |
| 2.4.3. 蛋白晶体条件优化 | 第27页 |
| 2.5. 结构数据收集,处理和结构解析 | 第27页 |
| 2.6. ITC实验 | 第27-28页 |
| 2.7. 定点突变 | 第28-31页 |
| 2.7.1. 点突变PCR体系和参数 | 第29页 |
| 2.7.2. DpnI消化PCR产物中剩余模板 | 第29-30页 |
| 2.7.3. 转化Top10感受态细胞并抽提质粒测序 | 第30-31页 |
| 第三章 MapA蛋白表达纯化、结构分析 | 第31-44页 |
| 3.1. MapA蛋白表达纯化 | 第31-37页 |
| 3.1.1. 克隆构建 | 第31页 |
| 3.1.3. 蛋白纯化 | 第31-33页 |
| 3.1.4. MapA蛋白晶体生长条件筛选 | 第33-34页 |
| 3.1.5. 晶体数据收集,处理,结构解析 | 第34-37页 |
| 3.2. MapA的结构展示 | 第37-42页 |
| 3.2.1. MapA native蛋白质结构解析 | 第37页 |
| 3.2.2. MapA native蛋白质结构描述 | 第37-39页 |
| 3.2.3. MapA突变体D281结合5'-AMP结构描述 | 第39-42页 |
| 3.3. MapA晶体结构和其他HAP蛋白结构的比对 | 第42-44页 |
| 第四章 MapA蛋白酶活及底物结合机制探究 | 第44-54页 |
| 4.1. MapA蛋白点突变以及突变体的表达纯化 | 第44-47页 |
| 4.1.1. 环形质粒P | 第44-45页 |
| 4.1.2. DpnI消化环形质粒PCR突变的剩余模板 | 第45页 |
| 4.1.3. 转化并抽提质粒测序 | 第45-46页 |
| 4.1.4. 突变体蛋白表达并纯化 | 第46-47页 |
| 4.2. MapA/突变体的酸性磷酸酶活性测定 | 第47-51页 |
| 4.2.1. MapA酸性磷酸酶活性测定原理 | 第47页 |
| 4.2.2. MapA酸性磷酸酶的酶活标准曲线的绘制 | 第47-51页 |
| 4.3. ITC | 第51-54页 |
| 第五章 结论、讨论与展望 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-59页 |
| 附录 | 第59-62页 |
| 致谢 | 第62-63页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第63页 |
