| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 绪论 | 第9-20页 |
| 1 PEF钙连接蛋白家族的研究进展 | 第9-12页 |
| 1.1 PEF蛋白的共同特征 | 第10页 |
| 1.2 PEF蛋白家族成员 | 第10-12页 |
| 1.2.1 Calpain亚族 | 第10页 |
| 1.2.2 Sorsin | 第10页 |
| 1.2.3 Grancalcin | 第10-11页 |
| 1.2.4 ALG-2 | 第11页 |
| 1.2.5 Peflin | 第11-12页 |
| 2 哺乳动物及真菌中凋亡相关基因-2(ALG-2)功能的研究进展 | 第12-16页 |
| 2.1 ALG-2的一般结构特征 | 第12-14页 |
| 2.2 ALG-2的功能 | 第14-16页 |
| 2.2.1 ALG-2亚细胞结构的定位 | 第14-15页 |
| 2.2.2 ALG-2调节物质分选和囊泡运输 | 第15页 |
| 2.2.3 ALG-2调节物质由内质网向高尔基体的运输。 | 第15-16页 |
| 2.3 ALG-2的同源蛋白在真菌中的研究进展 | 第16页 |
| 3 条件致病真菌烟曲霉的特点 | 第16-17页 |
| 4 本课题的研究内容思路和方法 | 第17-20页 |
| 4.1 研究内容 | 第17-19页 |
| 4.2 研究思路和研究方法 | 第19-20页 |
| 第二章 烟曲霉pefA敲除菌株Grs01的构建和鉴定 | 第20-30页 |
| 1 材料与方法 | 第20-25页 |
| 1.1 菌种、质粒及培养条件 | 第20-21页 |
| 1.2 试剂与仪器 | 第21页 |
| 1.3 引物设计 | 第21-23页 |
| 1.4 融合PCR | 第23-24页 |
| 1.5 烟曲霉原生质体的制备及转化 | 第24-25页 |
| 1.6 转化子的进一步PCR验证 | 第25页 |
| 2 实验结果 | 第25-29页 |
| 2.1 左侧翼序列和右侧翼序列的扩增 | 第25-26页 |
| 2.2 Cassette上pyr4片段PCR扩增结果 | 第26页 |
| 2.3 Fusion PCR全长片段的扩增 | 第26-28页 |
| 2.4 烟曲霉转化子的PCR诊断 | 第28-29页 |
| 3 讨论 | 第29-30页 |
| 第三章 烟曲霉PefA敲除菌株Grs01的表型测试 | 第30-37页 |
| 1 材料和方法 | 第30-31页 |
| 1.1 菌种及培养条件和所用试剂 | 第30页 |
| 1.2 固体琼脂平板稀释法测定Grs01菌株对于各种药物的敏感性 | 第30-31页 |
| 1.3 体外丝状真菌最低抑菌浓度(MIC)的检测方法 | 第31页 |
| 2 实验结果 | 第31-36页 |
| 2.1 测定Grs01菌株对于各种药物的敏感性 | 第31-35页 |
| 2.2 伊曲康唑(ITZ)对Grs01的最低抑菌浓度(MIC)的检测结果 | 第35-36页 |
| 3 讨论 | 第36-37页 |
| 第四章 烟曲霉PefA回补菌株Grs02的构建和验证 | 第37-47页 |
| 1 材料与方法 | 第38-41页 |
| 1.1 菌种、质粒及培养条件 | 第38-39页 |
| 1.2 引物设计 | 第39-40页 |
| 1.3 含有pefA cassette和HPH cassette的质粒的构建 | 第40页 |
| 1.4 新方法制备烟曲霉原生质体及转化 | 第40-41页 |
| 2 实验结果 | 第41-46页 |
| 2.1 pefA cassette片段的扩增 | 第41-42页 |
| 2.2 HPH cassette片段的扩增 | 第42页 |
| 2.3 质粒pEASY-Blunt-pefA的酶切验证 | 第42-43页 |
| 2.4 HpH cassette片段连接至pEASY-Blunt-pefA质粒上的验证 | 第43-44页 |
| 2.5 转化子表型测试 | 第44-45页 |
| 2.6 PefA回补菌株Grs02的PCR诊断结果 | 第45-46页 |
| 3 讨论 | 第46-47页 |
| 第五章 烟曲霉PefA荧光标记菌株Grs03的构建和鉴定 | 第47-59页 |
| 1 材料与方法 | 第48-53页 |
| 1.1 菌种、质粒及培养条件 | 第48页 |
| 1.2 试剂与仪器 | 第48-49页 |
| 1.3 引物设计 | 第49-50页 |
| 1.4 融合PCR | 第50-51页 |
| 1.5 烟曲霉原生质体的制备及转化 | 第51-52页 |
| 1.6 转化子的进一步PCR验证 | 第52页 |
| 1.7 PefA-GFP融合蛋白的表达鉴定 | 第52-53页 |
| 2 实验结果 | 第53-58页 |
| 2.1 左侧翼序列和右侧翼序列的扩增 | 第53-54页 |
| 2.2 Cassette上GA-GFP-AfpyrG片段PCR扩增结果 | 第54页 |
| 2.3 Fusion PCR全长片段的扩增 | 第54-56页 |
| 2.4 转化子的筛选 | 第56-57页 |
| 2.5 烟曲霉转化子的PCR诊断 | 第57页 |
| 2.6 菌株Grs03中PefA-c-GFP融合蛋白的表达的鉴定 | 第57-58页 |
| 3 讨论 | 第58-59页 |
| 第六章 AfPefA与烟曲霉对唑类药物耐药的关系 | 第59-72页 |
| 1 材料与方法 | 第59-62页 |
| 1.1 菌株及培养条件 | 第59页 |
| 1.2 试剂及仪器 | 第59-60页 |
| 1.3 方法 | 第60-62页 |
| 1.3.1 抽提菌丝麦角固醇的方法 | 第60页 |
| 1.3.2 菌液制备与染料负载 | 第60-61页 |
| 1.3.3 ITZ药物刺激下菌株凋亡情况的测试 | 第61页 |
| 1.3.4 菌株在ITZ药敏板上存活率的测试 | 第61-62页 |
| 1.3.5 PefA敲除菌ITZ耐药菌株的诱导 | 第62页 |
| 1.3.6 E-test assay测试菌株对于药物的敏感性 | 第62页 |
| 2 实验结果 | 第62-71页 |
| 2.1 PefA敲除菌和野生型麦角固醇含量的测试结果 | 第62-63页 |
| 2.2 Grs01与野生型菌药物外排泵活力的比较 | 第63-64页 |
| 2.3 高浓度ITZ下Grs01与野生型菌凋亡情况的测试 | 第64-65页 |
| 2.4 Grs01和WT在ITZ药敏板上存活率的测试 | 第65-66页 |
| 2.5 PefA缺失菌Grs01的ITZ耐药菌株的筛选和诱导 | 第66-67页 |
| 2.6 Grs04的耐药性的测试及其表型的探索 | 第67页 |
| 2.7 对Grs04的表型的探索 | 第67-71页 |
| 3 讨论 | 第71-72页 |
| 第七章 结论 | 第72-73页 |
| 附录A | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-83页 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 | 第83-84页 |
| 致谢 | 第84页 |
