| 个人简历 | 第3-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 前言 | 第12-15页 |
| 1 材料 | 第15-21页 |
| 1.1 菌种及质粒 | 第15页 |
| 1.2 主要实验试剂 | 第15-17页 |
| 1.3 主要试剂的配制方法 | 第17-19页 |
| 1.4 主要设备和仪器 | 第19-21页 |
| 2 方法 | 第21-37页 |
| 2.1 引物的设计 | 第21页 |
| 2.1.1 Tim-3 胞外段PCR引物的设计 | 第21页 |
| 2.1.2 EGFP片段PCR引物的设计 | 第21页 |
| 2.2 总RNA的提取 | 第21-23页 |
| 2.2.1 全血样本的淋巴细胞分离 | 第21-22页 |
| 2.2.2 RNA提取 | 第22-23页 |
| 2.3 RT-PCR扩增sTim-3 片段 | 第23-24页 |
| 2.3.1 逆转录扩增cDNA | 第23-24页 |
| 2.3.2 PCR扩增sTIM-3 片段 | 第24页 |
| 2.4 sTim-3 片段的鉴定与纯化回收 | 第24-26页 |
| 2.4.1 琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物 | 第24-25页 |
| 2.4.2 纯化PCR产物 | 第25-26页 |
| 2.5 感受态大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)的制备 | 第26-27页 |
| 2.6 T载体克隆的构建与鉴定 | 第27-30页 |
| 2.6.1 T载体与sTim-3 片段的连接、转化 | 第27-28页 |
| 2.6.2 转化产物的菌液PCR鉴定 | 第28页 |
| 2.6.3 提取重组质粒 | 第28-29页 |
| 2.6.4 重组质粒的双酶切鉴定 | 第29-30页 |
| 2.6.5 测序鉴定 | 第30页 |
| 2.7 pET28a-sTim3EGFP重组质粒的构建与鉴定 | 第30-32页 |
| 2.8 sTim3EGFP融合蛋白的诱导表达与鉴定 | 第32-36页 |
| 2.8.1 重组蛋白的初步诱导观察 | 第32页 |
| 2.8.2 重组蛋白的SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色观察 | 第32-34页 |
| 2.8.3 重组蛋白的Western blot分析 | 第34-36页 |
| 2.9 sTim3EGFP融合蛋白诱导表达条件的优化 | 第36-37页 |
| 2.9.1 sTim3EGFP重组蛋白的诱导表达的IPTG浓度最佳化 | 第36页 |
| 2.9.2 sTim3EGFP重组蛋白的诱导时机最佳化 | 第36页 |
| 2.9.3 sTim3EGFP重组蛋白的诱导时间及温度最佳化 | 第36-37页 |
| 3 结果 | 第37-45页 |
| 3.1 Tim-3 胞外段基因的RT-PCR结果 | 第37-39页 |
| 3.2 T载体构建质粒的验证 | 第39页 |
| 3.3 重组质粒pET28a-sTim3EGFP的鉴定 | 第39-40页 |
| 3.4 IPTG诱导表达前后菌液的对比观察 | 第40-41页 |
| 3.5 sTim3EGFP重组蛋白的鉴定 | 第41-42页 |
| 3.6 sTim3EGFP重组蛋白的诱导表达的IPTG浓度最佳化 | 第42-43页 |
| 3.7 sTim3EGFP重组蛋白的诱导时机的最佳化 | 第43-44页 |
| 3.8 sTim3EGFP重组蛋白的诱导时间及温度最佳化 | 第44-45页 |
| 4 讨论 | 第45-48页 |
| 参考文献 | 第48-50页 |
| 附录 | 第50-52页 |
| 综述 | 第52-69页 |
| 参考文献 | 第64-69页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文情况 | 第69-70页 |
| 致谢 | 第70页 |
