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基于宽场倒置荧光显微镜的三通道荧光共振能量转移(FRET)实验技术平台的建立及其在活细胞定量荧光显微成像中的运用

摘要第9-13页
ABSTRACT第13-17页
英文缩写第18-19页
综述:荧光共振能量转移技术概述第19-25页
    第一节 FRET技术概述第19-21页
    第二节 FRET技术基本原理第21-25页
第一章 宽场FRET显微镜成像实验技术平台的建立第25-38页
    第一节 供受体荧光光谱窜扰及渗漏参数的测定第26-32页
        1. 实验材料及方法第27-29页
            1.1 质粒大量制备第27页
            1.2 细胞培养第27页
            1.3 基因转染第27页
            1.4 活细胞观察第27-28页
            1.5 活细胞图像采集第28页
            1.6 图像荧光强度测定及参数a参数b值的测定第28-29页
        2. 实验结果第29-30页
            2.1 参数a的测定第29-30页
            2.2 参数b的测定第30页
        3. 实验结果讨论第30-32页
    第二节 公式选择和阳性及阴性实验组FRET测定第32-38页
        1. 实验材料及方法第33-35页
            1.1 阳性对照质粒的构建第33页
            1.2 细胞培养(见前节)第33页
            1.3 基因转染第33-34页
            1.4 活细胞观察(见前节)第34页
            1.5 活细胞图像采集(见前节)第34页
            1.6 均一化数学公式及图像处理方法第34-35页
            1.7 基于FRET信号强度的活细胞色彩图的制作第35页
            1.8 数据的统计处理第35页
        2. 实验结果第35-37页
            2.1 FRET测定及利用不同数学均一化公式的计算结果第35-36页
            2.2 活细胞成像实验结果第36-37页
        3. 实验结果讨论第37-38页
第二章 通过c-Fos/c-Jun异源蛋白二聚化数学模型研究活细胞中不同供体与受体浓度比例对FRET成像公式的影响第38-55页
    1. 实验材料及方法第39-44页
        1.1 CFP-Jun与YFP-Fos以及YFP-Fos(delta Zip)质粒的构建第39-40页
        1.2 细胞培养(见前章节)第40页
        1.3 基因转染第40页
        1.4 活细胞观察(见前章节)第40页
        1.5 活细胞图像采集(见前章节)第40页
        1.6 显微镜上测定G参数的方法第40-44页
        1.7 统计学处理方法第44页
    2. 实验结果第44-50页
        2.1 Fos/Jun异源相互作用的测定第44-47页
        2.2 在不同浓度比例的CFP-Jun和YFP-Fos下用三通道FRET显微镜研究CFP-Jun和YFP-Fos的异源二聚化相互作用第47-50页
    3. 实验结果讨论第50-55页
第三章 运用FRET技术研究活细胞内FADD自身相互作用第55-75页
    1. 实验材料及方法第56-62页
        1.1 FADD及其变体荧光融合蛋白的构建第56-59页
        1.2 细胞培养(见前节)第59页
        1.3 基因转染第59页
        1.4 定性荧光光谱实验第59-60页
        1.5 基于三通道荧光显微镜定量敏化FRET的测量第60-61页
        1.6 细胞凋亡的荧光显微观察第61页
        1.7 统计学处理第61-62页
    2. 实验结果第62-71页
        2.1 定性荧光光谱实验测定FADD及其变体自身的相互作用第62-64页
        2.2 FRET显微镜定量研究FADD及其变体在活细胞中的相互作用第64-70页
        2.3 转染FADD及其变体细胞相对凋亡率统计第70-71页
    3. 实验结果讨论第71-75页
第四章 基于FRET技术的活细胞钙离子荧光探针的构建第75-87页
    1. 实验材料及方法第77-80页
        1.1 基于荧光蛋白的钙离子探针的构建第77-79页
        1.2 细胞培养(见前节)第79页
        1.3 基因转染第79页
        1.4 活细胞荧光比例成像第79-80页
    2. 实验结果第80-83页
        2.1 探针活细胞荧光比例成像全记录第80-82页
        2.2 伪彩色图显示内源性钙离子的释放和外源性钙离子的进入第82-83页
    3. 实验结果讨论第83-87页
第五章 基于FRET技术的活细胞锌离子荧光探针的构建第87-107页
    1. 实验材料及方法第89-94页
        1.1 基于荧光蛋白的锌离子探针的构建第89-90页
        1.2 蛋白体外表达及纯化第90页
        1.3 等温滴定方法体外测定锌离子和铜离子与探针的结合第90-91页
        1.4 探针体外荧光光谱检测第91页
        1.5 探针体外结合金属离子特异性检测第91页
        1.6 金属离子竞争结合性实验第91-92页
        1.7 探针活细胞内用于锌离子的成像检测第92-94页
    2. 实验结果第94-104页
        2.1 探针ECFP-MT2A-α-cpCitrine174的体外锌离子铜离子结合测定第94-96页
        2.2 荧光光谱实验证实探针可高效的对锌离子作出反应.第96-98页
        2.3 探针对各种金属离子的反应性检测第98-100页
        2.4 金属离子竞争性试验第100-101页
        2.5 活细胞成像实验证明探针在活体内能很好的监测锌离子的变化第101-104页
    3. 实验结果讨论第104-107页
参考文献第107-121页
全文总结第121-122页
附录一:主要的仪器设备和试剂第122-125页
附录二:博士在读期间发表论文及参编教材第125-127页
致谢第127-129页

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