| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 英文缩略表 | 第16-17页 |
| 第一章 引言 | 第17-30页 |
| 1.1 犬瘟热病毒 | 第17-21页 |
| 1.1.1 犬瘟热病毒病原学 | 第17-19页 |
| 1.1.2 犬瘟热病毒基因组及N蛋白研究进展 | 第19-21页 |
| 1.2 犬瘟热病毒单克隆抗体的研究 | 第21-23页 |
| 1.2.1 犬瘟热病毒单克隆抗体的制备 | 第21页 |
| 1.2.2 犬瘟热病毒B细胞表位 | 第21-22页 |
| 1.2.3 犬瘟热病毒单链抗体 | 第22-23页 |
| 1.3 犬瘟热病毒诊断技术研究 | 第23-24页 |
| 1.3.1 犬瘟热病毒病原学诊断 | 第24页 |
| 1.3.2 犬瘟热病毒血清学诊断 | 第24页 |
| 1.4 犬瘟热病毒疫苗研究进展 | 第24-25页 |
| 1.4.1 犬瘟热病毒毒株及疫苗 | 第24-25页 |
| 1.4.2 犬瘟热病毒新型疫苗 | 第25页 |
| 1.4.3 犬瘟热病毒免疫失败原因 | 第25页 |
| 1.5 腺病毒作为载体在动物疫苗中的研究进展 | 第25-26页 |
| 1.6 肉食动物细小病毒 | 第26-29页 |
| 1.6.1 肉食动物细小病毒概述 | 第26-27页 |
| 1.6.2 基因组特征 | 第27页 |
| 1.6.3 犬细小病毒 | 第27-28页 |
| 1.6.4 犬细小病毒变异和VP2蛋白氨基酸突变 | 第28页 |
| 1.6.5 我国犬细小病毒流行状况 | 第28-29页 |
| 1.7 研究的目的和意义 | 第29-30页 |
| 第二章 CDV N蛋白单克隆抗体的制备 | 第30-41页 |
| 摘要 | 第30页 |
| 2.1 材料与方法 | 第30-36页 |
| 2.1.1 主要实验试剂 | 第30-31页 |
| 2.1.2 毒株及实验动物 | 第31页 |
| 2.1.3 主要仪器和耗材 | 第31页 |
| 2.1.4 N蛋白截短蛋白(aa277-471)基因PCR | 第31页 |
| 2.1.5 N蛋白截短蛋白(aa277-471)表达载体构建 | 第31-32页 |
| 2.1.6 p EASY-N表达菌株诱导表达 | 第32-33页 |
| 2.1.7 重组CDV-N蛋白表达预处理 | 第33页 |
| 2.1.8 N蛋白表达Ni-NTA纯化 | 第33页 |
| 2.1.9 N蛋白SDS-PAGE分析 | 第33页 |
| 2.1.10 CDV-N蛋白免疫程序 | 第33页 |
| 2.1.11 N蛋白间接ELISA检测方法的建立 | 第33-34页 |
| 2.1.12细胞融合试验 | 第34页 |
| 2.1.13阳性杂交瘤细胞的筛选 | 第34页 |
| 2.1.14 MAbs腹水的制备 | 第34-35页 |
| 2.1.15间接免疫荧光（IFA）鉴定 | 第35页 |
| 2.1.16 MAb的Western blot鉴定 | 第35页 |
| 2.1.17 MAb上清与腹水效价测定以及亚类鉴定 | 第35页 |
| 2.1.18 MAb 的初步应用：抗体与 HRP 及 488 偶联 | 第35-36页 |
| 2.2 结果 | 第36-40页 |
| 2.2.1 N基因的PCR扩增 | 第36页 |
| 2.2.2 重组供体质粒p EASY-N的鉴定 | 第36页 |
| 2.2.3 p EASY-N重组质粒的表达与纯化 | 第36-37页 |
| 2.2.4 间接ELISA检测法的建立 | 第37页 |
| 2.2.5 阳性杂交瘤细胞株的获得 | 第37页 |
| 2.2.6 MAb上清与腹水效价测定以及亚型鉴定 | 第37-38页 |
| 2.2.7 MAb的IFA鉴定 | 第38-39页 |
| 2.2.8 MAb的Western blot鉴定 | 第39页 |
| 2.2.9 MAb的初步应用：抗体与HRP及488偶联 | 第39-40页 |
| 2.3 讨论 | 第40-41页 |
| 2.3.1 CDV单克隆抗体的制备 | 第40页 |
| 2.3.2 选择CDV N蛋白的原因 | 第40页 |
| 2.3.3 CDV单克隆抗体国内外应用进展 | 第40-41页 |
| 第三章 筛选犬瘟热病毒N蛋白（AA 277-471）B细胞表位 | 第41-50页 |
| 摘要 | 第41页 |
| 3.1 材料与方法 | 第41-44页 |
| 3.1.1 主要实验试剂 | 第41页 |
| 3.1.2 单克隆抗体 1N8的纯化 | 第41-42页 |
| 3.1.3 噬菌体筛选与扩增 | 第42页 |
| 3.1.4 阳性噬菌体序列测定 | 第42页 |
| 3.1.5 犬瘟热病毒N蛋白（aa277-471）合成肽的制备 | 第42-43页 |
| 3.1.6 抗原表位的初步鉴定（肽扫描） | 第43页 |
| 3.1.7 抗原表位的精确鉴定 | 第43页 |
| 3.1.8 抗原表位的特异性鉴定 | 第43页 |
| 3.1.9 抗原表位合成多肽与CDV阳性/阴性血清ELISA反应 | 第43页 |
| 3.1.10 抗原表位的 3D位置 | 第43-44页 |
| 3.2 实验结果 | 第44-48页 |
| 3.2.1 单抗腹水纯化 | 第44页 |
| 3.2.2 肽库淘选 | 第44页 |
| 3.2.3 随机噬菌体的测序结果 | 第44-45页 |
| 3.2.4 肽扫描结果 | 第45页 |
| 3.2.5 抗原表位的精确鉴定 | 第45-46页 |
| 3.2.6 抗原表位的比对 | 第46-47页 |
| 3.2.7 1N8与小反刍兽疫病毒的WB检验 | 第47页 |
| 3.2.8 抗原表位351NFGRSYFDP359在N蛋白中的 3D位置 | 第47-48页 |
| 3.2.9 抗原表位351NFGRSYFDP359与CDV阳性血清反应能力 | 第48页 |
| 3.3 讨论 | 第48-50页 |
| 3.3.1 CDV N蛋白B细胞抗原表位 | 第48页 |
| 3.3.2 麻疹病毒属N蛋白抗原表位分析 | 第48-50页 |
| 第四章 基于杂交瘤细胞 1N8的单链抗体制备与鉴定 | 第50-57页 |
| 摘要 | 第50页 |
| 4.1 材料与方法 | 第50-53页 |
| 4.1.1 细胞与菌株 | 第50页 |
| 4.1.2 主要实验试剂 | 第50页 |
| 4.1.3 引物设计 | 第50-51页 |
| 4.1.4 杂交瘤的RNA提取，c DNA合成和基因扩增 | 第51页 |
| 4.1.5 单链抗体sc Fv/1N8 gene的合成 | 第51页 |
| 4.1.6 原核表达重组质粒的构建 | 第51-52页 |
| 4.1.7 单链抗体基因的序列比对分析 | 第52页 |
| 4.1.8 单链抗体的表达 | 第52页 |
| 4.1.9 重组蛋白的纯化 | 第52页 |
| 4.1.10 重组蛋白的复性 | 第52页 |
| 4.1.11 蛋白浓度的测定 | 第52-53页 |
| 4.1.12 单链抗体活性检测 | 第53页 |
| 4.2 结果 | 第53-56页 |
| 4.2.1 sc Fv/1N8 gene基因的扩增结果 | 第53页 |
| 4.2.2 sc Fv/1N8 gene基因的序列分析 | 第53-54页 |
| 4.2.3 sc Fv/1N8重组蛋白的表达与纯化 | 第54页 |
| 4.2.4 sc Fv/1N8重组蛋白的活性检测 | 第54-56页 |
| 4.3 讨论 | 第56-57页 |
| 4.3.1 CDV单链抗体的研究 | 第56页 |
| 4.3.2 CDV单链抗体的构建方式 | 第56页 |
| 4.3.3 CDV不同蛋白单链抗体的未来展望 | 第56-57页 |
| 第五章 CDV 351NFGRSYFDP359表位疫苗研究 | 第57-65页 |
| 摘要 | 第57页 |
| 5.1 材料与方法 | 第57-59页 |
| 5.1.1 腺病毒表达载体和试剂 | 第57页 |
| 5.1.2 含目的基因(表位+VP2)的PCR扩增 | 第57-58页 |
| 5.1.3 含目的基因(表位+VP2)穿梭载体的构建 | 第58页 |
| 5.1.4 重组腺病毒载体菌内重组鉴定 | 第58页 |
| 5.1.5 重组腺病毒质粒转染HEK293细胞 | 第58页 |
| 5.1.6 重组腺病毒滴度（TCID50）的滴定 | 第58页 |
| 5.1.7 重组腺病毒的形态学观察 | 第58页 |
| 5.1.8 重组腺病毒的PCR鉴定 | 第58-59页 |
| 5.1.9 重组腺病毒的WB鉴定 | 第59页 |
| 5.1.10 重组病毒免疫小鼠实验 | 第59页 |
| 5.2 结果 | 第59-63页 |
| 5.2.1 PCR扩增结果 | 第59页 |
| 5.2.2 含目的基因(表位+VP2)穿梭载体的构建结果 | 第59-60页 |
| 5.2.3 重组腺病毒的包装 | 第60页 |
| 5.2.4 重组病毒滴度（TCID50）的测定 | 第60-61页 |
| 5.2.5 重组腺病毒的电镜观察 | 第61页 |
| 5.2.6 重组腺病毒的VP2基因PCR结果 | 第61-62页 |
| 5.2.7 重组腺病毒的Western blot检测 | 第62页 |
| 5.2.8 重组腺病毒免疫小鼠后CPV抗体效价 | 第62页 |
| 5.2.9 重组腺病毒免疫小鼠后CDV抗体效价 | 第62-63页 |
| 5.3 讨论 | 第63-65页 |
| 5.3.1 腺病毒载体的优势 | 第63页 |
| 5.3.2 CPV VP2基因的VLP特征 | 第63-64页 |
| 5.3.3 CDV表位疫苗 | 第64-65页 |
| 第六章 犬细小病毒VP2基因的遗传变异分析 | 第65-78页 |
| 摘要 | 第65页 |
| 6.1 材料与方法 | 第65-68页 |
| 6.1.1 菌株、载体和试剂 | 第65页 |
| 6.1.2 CPV基因组提取方法 | 第65-66页 |
| 6.1.3 用于CPV毒株遗传进化分析的毒株信息 | 第66页 |
| 6.1.4 CPV PCR扩增 | 第66-67页 |
| 6.1.5 CPV特异性片段的PCR扩增与RFLP分析 | 第67页 |
| 6.1.6 CPV VP2基因的克隆 | 第67页 |
| 6.1.7 利用实时荧光定量PCR相对定量法检测CPV病毒含量 | 第67-68页 |
| 6.1.8 犬细小病毒分离 | 第68页 |
| 6.1.9 犬细小病毒系统发育树的构建 | 第68页 |
| 6.2 试验结果 | 第68-76页 |
| 6.2.1 样品中细小病毒的常规PCR鉴定 | 第68页 |
| 6.2.2 犬细小病毒RFLP分析 | 第68-69页 |
| 5.2.3 犬细小病毒病毒分离 | 第69页 |
| 6.2.4 犬细小病毒VP2基因的克隆 | 第69-70页 |
| 6.2.5 实时荧光定量PCR相对定量方法测定细小病毒载量 | 第70页 |
| 6.2.6 犬细小病毒VP2基因的序列分析 | 第70-71页 |
| 5.2.7 犬细小病毒VP2基因的同义突变与非同义突变 | 第71页 |
| 6.2.8 CPV VP2基因系统发育树分析 | 第71-76页 |
| 6.3 讨论 | 第76-78页 |
| 6.3.1 我国CPV流行趋势分析 | 第76页 |
| 6.3.2 VP2蛋白氨基酸变异分析 | 第76-77页 |
| 6.3.3 我国CPV免疫保护分析 | 第77页 |
| 6.3.4 CPV及其他犬科动物感染细小病毒联系 | 第77-78页 |
| 第六章 全文结论 | 第78-79页 |
| 附录 | 第79-84页 |
| 参考文献 | 第84-97页 |
| 致谢 | 第97-98页 |
| 作者简历 | 第98页 |
