| 摘要 | 第3-5页 |
| SUMMARY | 第5-6页 |
| 第一章 综述 | 第10-20页 |
| 1 PEDV的概述 | 第10-15页 |
| 1.1 PED的流行特征 | 第10页 |
| 1.2 PEDV的病原学特性 | 第10-11页 |
| 1.3 PEDV基因组特征 | 第11-12页 |
| 1.4 PEDV S基因的功能特性 | 第12-13页 |
| 1.5 PEDV S基因变异 | 第13页 |
| 1.6 PED疫苗的研究及应用状况 | 第13-15页 |
| 1.6.1 传统疫苗 | 第13-14页 |
| 1.6.2 新型疫苗 | 第14-15页 |
| 2 PRV的概述 | 第15-17页 |
| 2.1 PRV的病原学特征 | 第15页 |
| 2.2 PRV的基因组特征 | 第15-16页 |
| 2.3 PRV糖蛋白毒力相关基因 | 第16页 |
| 2.4 猪伪狂犬疫苗的研究 | 第16-17页 |
| 2.4.1 PRV基因缺失疫苗 | 第16-17页 |
| 2.4.2 PRV活载体疫苗 | 第17页 |
| 3 细菌人工染色体 | 第17-20页 |
| 3.1 BAC的研究与进展 | 第17-18页 |
| 3.2 BAC克隆常用的定位修饰方法 | 第18-20页 |
| 第二章 PEDV S与ORF3基因遗传进化分析及优势流行株的筛选 | 第20-31页 |
| 1 材料 | 第20-21页 |
| 1.1 病毒和工程菌 | 第20页 |
| 1.2 主要试剂 | 第20-21页 |
| 2 实验方法 | 第21-23页 |
| 2.1 设计引物与合成 | 第21页 |
| 2.2 PEDV RNA的提取 | 第21页 |
| 2.3 S基因各片段的扩增和鉴定 | 第21-22页 |
| 2.4 S基因各片段的克隆和测序 | 第22页 |
| 2.5 S基因和ORF3基因的测序与对比分析 | 第22-23页 |
| 3 结果 | 第23-29页 |
| 3.1 PEDV S和ORF3基因克隆 | 第23页 |
| 3.2 PEDV S和ORF3基因克隆的鉴定 | 第23页 |
| 3.3 PEDV S基因的同源性和遗传变异分析 | 第23-27页 |
| 3.4 S基因的遗传进化 | 第27-28页 |
| 3.5 S蛋白抗原位点变化分析 | 第28-29页 |
| 3.6 ORF3氨基酸序列同源性分析 | 第29页 |
| 4 讨论 | 第29-31页 |
| 第三章 表达PEDV S蛋白的重组PRV的构建 | 第31-50页 |
| 1 材料 | 第31-32页 |
| 1.1 菌（毒）株、质粒和细胞 | 第31页 |
| 1.2 实验试剂 | 第31-32页 |
| 2 方法 | 第32-41页 |
| 2.1 PEDV S基因的优化 | 第32页 |
| 2.2 引物设计与合成 | 第32-33页 |
| 2.3 真核表达质粒PEP-S1-END和PEP-S2-END的构建 | 第33-35页 |
| 2.3.1 重组质粒PUC57-S和真核表达载体酶切 | 第33页 |
| 2.3.2 表达载体与目的基因连接 | 第33页 |
| 2.3.3 连接产物的转化 | 第33-34页 |
| 2.3.4 扩大培养重组菌 | 第34页 |
| 2.3.5 重组菌的菌液PCR鉴定 | 第34-35页 |
| 2.3.6 重组质粒的测序鉴定 | 第35页 |
| 2.3.7 重组质粒的提取及鉴定 | 第35页 |
| 2.4 真核质粒的体外瞬时转染 | 第35页 |
| 2.5 间接免疫荧光法检测转染水平 | 第35-36页 |
| 2.6 表达PEDV S1和S2蛋白的重组PRV的构建 | 第36-38页 |
| 2.6.1 RED重组PCR产物的制备 | 第36页 |
| 2.6.2 PCR产物的回收和纯化 | 第36页 |
| 2.6.3 PCR产物模板质粒的去除 | 第36页 |
| 2.6.4 酶切产物的回收 | 第36-37页 |
| 2.6.5 PRV-BAC ZJ株的PCMV启动子更换 | 第37页 |
| 2.6.6 pPRV-EF1-KAN突变体KAN基因的删除 | 第37页 |
| 2.6.7 pPRV-EF1/GS1783电转化感受态细胞的制备 | 第37-38页 |
| 2.6.8 pPRV-S-ΔGIE突变体的构建 | 第38页 |
| 2.7 拯救rPRV-S1-ΔGIE和rPRV-S2-ΔGIE重组病毒 | 第38-40页 |
| 2.7.1 提取pPRV-S1-ΔGIE和pPRV-S2-ΔGIE质粒及酶切鉴定 | 第38-39页 |
| 2.7.2 rPRV-S1-ΔGIE和rPRV-S2-ΔGIE重组病毒的拯救 | 第39-40页 |
| 2.7.3 删除rPRV-S1-ΔGIE和rPRV-S2-ΔGIE中的KAN基因并拯救 | 第40页 |
| 2.8 WESTERN BLOT检测PEDV S蛋白的表达 | 第40页 |
| 2.9 重组病毒免疫小鼠试验 | 第40-41页 |
| 3 试验结果 | 第41-47页 |
| 3.1 重组表达质粒PEP-S1-END和PEP-S2-END的构建和鉴定 | 第41-42页 |
| 3.2 PEP-S1-END和PEP-S2-END质粒体外瞬时转染 | 第42页 |
| 3.3 表达PEDV S1和S2蛋白的重组PRV的构建 | 第42-47页 |
| 3.3.1 RED重组PCR产物的制备 | 第42-43页 |
| 3.3.2 PCR产物模板质粒的去除 | 第43页 |
| 3.3.3 提取pPRV-S1-ΔGIE和pPRV-S2-ΔGIE质粒及酶切鉴定 | 第43-44页 |
| 3.3.4 拯救rPRV-S1-ΔGIE和rPRV-S2-ΔGIE重组病毒 | 第44页 |
| 3.3.5 删除rPRV-S1-ΔGIE和rPRV-S2-ΔGIE中的KAN基因并拯救 | 第44-45页 |
| 3.3.6 拯救删除KAN基因的rPRV-S1-ΔGIE和rPRV-S2-ΔGIE重组病毒 | 第45页 |
| 3.3.7 重组病毒表达蛋白的WESTERN BLOT检测 | 第45-46页 |
| 3.3.8 免疫小鼠抗体检测 | 第46-47页 |
| 4 讨论 | 第47-48页 |
| 4.1 KOZAK的调控作用 | 第47页 |
| 4.2 RED同源重组 | 第47页 |
| 4.3 PEDV S基因的真核表达 | 第47-48页 |
| 5 结论 | 第48-50页 |
| 参考文献 | 第50-57页 |
| 致谢 | 第57-58页 |
| 附录 | 第58-64页 |
| 作者简介 | 第64-65页 |
| 导师简介 | 第65-66页 |
