| 符号说明 | 第4-9页 |
| 中文摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 1 前言 | 第14-20页 |
| 1.1 水稻条纹病毒及其危害 | 第14页 |
| 1.2 水稻条纹病毒传播介体及介体传毒相关蛋白 | 第14-15页 |
| 1.3 RNA沉默技术及应用 | 第15-18页 |
| 1.3.1 RNA沉默技术 | 第15-16页 |
| 1.3.2 RNA沉默技术与基因功能研究 | 第16-17页 |
| 1.3.3 RNA沉默技术与抗病毒研究 | 第17-18页 |
| 1.4 本研究的目的及意义 | 第18-20页 |
| 2 材料与方法 | 第20-40页 |
| 2.1 实验材料 | 第20-22页 |
| 2.1.1 毒源 | 第20页 |
| 2.1.2 供试植物与昆虫 | 第20页 |
| 2.1.3 质粒和菌株 | 第20页 |
| 2.1.4 序列测定 | 第20页 |
| 2.1.5 酶和常用生化试剂 | 第20页 |
| 2.1.6 引物 | 第20-22页 |
| 2.2 方法 | 第22-40页 |
| 2.2.1 目的基因的克隆 | 第22-26页 |
| 2.2.1.1 灰飞虱总RNA的提取 | 第22页 |
| 2.2.1.2 目的基因的PCR扩增 | 第22-23页 |
| 2.2.1.3 DNA 片段的回收（试剂盒法) | 第23页 |
| 2.2.1.4 目的基因DNA片段与载体pMD18-T连接 | 第23页 |
| 2.2.1.5 感受态细胞制备 | 第23-24页 |
| 2.2.1.6 大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第24页 |
| 2.2.1.7 转化菌落PCR鉴定 | 第24页 |
| 2.2.1.8 质粒 DNA 的微量提取（试剂盒法） | 第24-26页 |
| 2.2.2 体外转录合成dsRNA | 第26页 |
| 2.2.3 体外合成dsRNA饲喂灰飞虱 | 第26-27页 |
| 2.2.4 qRT-PCR检测灰飞虱体内目的基因的表达水平 | 第27页 |
| 2.2.5 原核表达载体的构建 | 第27-28页 |
| 2.2.5.1 质粒DNA的酶切 | 第27-28页 |
| 2.2.5.2 目的片段与质粒DNA的连接 | 第28页 |
| 2.2.6 dsRNA的表达、提取和分析 | 第28-29页 |
| 2.2.6.1 dsRNA的诱导表达 | 第28页 |
| 2.2.6.2 Trizol法提取dsRNA | 第28-29页 |
| 2.2.6.3 高压破碎仪获得大量dsRNA | 第29页 |
| 2.2.7 原核表达dsRNA饲喂灰飞虱 | 第29页 |
| 2.2.8 原核表达dsRNA喷施野生型水稻 | 第29页 |
| 2.2.9 植物表达载体的构建 | 第29-30页 |
| 2.2.9.1 农杆菌的转化 | 第29-30页 |
| 2.2.10 农杆菌介导的水稻转化及转基因植株的获得 | 第30-32页 |
| 2.2.10.1 预培养 | 第30页 |
| 2.2.10.2 农杆菌的侵染和水稻共培养 | 第30页 |
| 2.2.10.3 转化植株的获得 | 第30-31页 |
| 2.2.10.4 转基因植株的PPT抗性检测 | 第31页 |
| 2.2.10.5 转基因植株总DNA的微量提取 | 第31页 |
| 2.2.10.6 再生植株的PCR检测 | 第31-32页 |
| 2.2.11 转基因植株的Southern blot分析 | 第32-35页 |
| 2.2.11.1 水稻总 DNA 的提取（苯酚法） | 第32页 |
| 2.2.11.2 转基因植株总DNA的酶切 | 第32-33页 |
| 2.2.11.3 总DNA凝胶电泳 | 第33页 |
| 2.2.11.4 DNA转膜 | 第33页 |
| 2.2.11.5 探针标记 | 第33-34页 |
| 2.2.11.6 DIG标记有效性的检测 | 第34页 |
| 2.2.11.7 预杂交与杂交 | 第34-35页 |
| 2.2.11.8 洗膜与显影 | 第35页 |
| 2.2.12 转基因植株的Northern blot分析 | 第35-37页 |
| 2.2.12.1 植株总 RNA 的提取（Trizol 法） | 第35页 |
| 2.2.12.2 总RNA的甲醛凝胶电泳 | 第35页 |
| 2.2.12.3 总RNA的转膜 | 第35-36页 |
| 2.2.12.4 探针制备（探针标记） | 第36页 |
| 2.2.12.5 DIG标记有效性检测 | 第36页 |
| 2.2.12.6 预杂交与杂交 | 第36-37页 |
| 2.2.12.7 洗膜与显影 | 第37页 |
| 2.2.13 植株siRNA的Northern blot分析 | 第37-38页 |
| 2.2.13.1 植株 si RNA 的提取（Purelink TM mi RNA isolation Kit 提取） | 第37页 |
| 2.2.13.2 siRNA聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第37-38页 |
| 2.2.13.3 siRNA的转膜 | 第38页 |
| 2.2.14 T_1代转基因水稻植株的RSV抗性鉴定 | 第38-40页 |
| 3 结果与分析 | 第40-54页 |
| 3.1 介体传毒相关蛋白基因的克隆及功能验证 | 第40-42页 |
| 3.1.1 灰飞虱GAPDH3、RACK基因的克隆 | 第40-41页 |
| 3.1.2 体外转录合成dsRNA | 第41页 |
| 3.1.3 体外合成dsRNA喂食灰飞虱后灰飞虱体内RSV的积累量 | 第41-42页 |
| 3.2 原核表达介体传毒相关蛋白基因及病毒基因的dsRNA防控病毒研究 | 第42-48页 |
| 3.2.1 原核表达载体的构建 | 第42-45页 |
| 3.2.1.1 目的基因正反向片段的获得 | 第42-43页 |
| 3.2.1.2 反向目的片段与载体pGEM-TEasy的连接 | 第43页 |
| 3.2.1.3 正向目的片段与重组中间载体的连接 | 第43-44页 |
| 3.2.1.4 RSV SP载体与重组表达载体的连接 | 第44-45页 |
| 3.2.2 大肠杆菌M-JM109lacY菌株的转化 | 第45页 |
| 3.2.3 dsRNA的诱导表达和提取 | 第45-46页 |
| 3.2.4 原核表达dsRNA喂食灰飞虱后灰飞虱体内RSV的积累量 | 第46-48页 |
| 3.2.5 原核表达dsRNA处理水稻后水稻中RSV的积累量 | 第48页 |
| 3.3 转基因表达介体传毒相关蛋白基因及病毒基因的dsRNA抗病毒研究 | 第48-54页 |
| 3.3.1 植物表达载体的构建 | 第48页 |
| 3.3.2 T_0代转基因植株的获得及鉴定 | 第48-50页 |
| 3.3.3 T_0代转基因植株Southern blot分析 | 第50-51页 |
| 3.3.4 T_0代转基因植株Northern blot分析 | 第51-52页 |
| 3.3.5 T_1代转基因水稻植株的RSV抗性鉴定 | 第52-54页 |
| 4 讨论 | 第54-58页 |
| 5 结论 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-64页 |
| 致谢 | 第64-65页 |
| 攻读学位期间发表的论文及成果 | 第65页 |
