| 摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-13页 |
| 符号说明 | 第14-16页 |
| 1. 前言 | 第16-20页 |
| 1.1 OCT4基因 | 第16-17页 |
| 1.1.1 OCT4基因的功能 | 第16页 |
| 1.1.2 OCT4基因与肿瘤 | 第16-17页 |
| 1.2 STAT3 | 第17-18页 |
| 1.2.1 STAT3的结构 | 第17-18页 |
| 1.2.2 STAT3与肿瘤 | 第18页 |
| 1.3 细胞色素C | 第18-20页 |
| 1.3.1 细胞色素C的结构和性质研究 | 第18-19页 |
| 1.3.2 细胞色素C与线粒体呼吸链 | 第19页 |
| 1.3.3 细胞色素C与细胞凋亡 | 第19-20页 |
| 2. 材料 | 第20-26页 |
| 2.1 质粒 | 第20页 |
| 2.1.1 质粒种类 | 第20页 |
| 2.1.2 质粒构建及转染所需试剂 | 第20页 |
| 2.2 细胞 | 第20-21页 |
| 2.2.1 细胞株 | 第20-21页 |
| 2.2.2 培养的细胞相关试剂 | 第21页 |
| 2.3 Western blot所用试剂 | 第21-22页 |
| 2.4 免疫共沉淀IP试剂 | 第22页 |
| 2.5 实验仪器和设备 | 第22-23页 |
| 2.6 试剂配制 | 第23-26页 |
| 2.6.1 质粒构建所用试剂的配制 | 第23-24页 |
| 2.6.2 细胞培养所需培养基配制 | 第24页 |
| 2.6.3 Western blotting相关溶液的配制 | 第24-25页 |
| 2.6.4 细胞蛋白裂解液的配制 | 第25-26页 |
| 3. 实验方法 | 第26-32页 |
| 3.1 细胞培养及相关材料 | 第26页 |
| 3.1.1 细胞293T,HeLa,STAT3 WT MEF,STAT3 -/- MEF的培养 | 第26页 |
| 3.2 细胞总蛋白的提取 | 第26-27页 |
| 3.3 细胞核,细胞浆和线粒体三部分蛋白的分离提取 | 第27-29页 |
| 3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第29-30页 |
| 3.5 蛋白印迹 | 第30-31页 |
| 3.6 质粒转染实验 | 第31-32页 |
| 4. 构建重组质粒 | 第32-44页 |
| 4.1 目的蛋白cDNA模板的制备 | 第32页 |
| 4.2 无内毒素质粒小抽试剂盒抽提纯化质粒 | 第32-34页 |
| 4.3 OCT4及其截断体、突变体的引物设计 | 第34-35页 |
| 4.4 PCR扩增OCT4各截断体的反应体系(50μl) | 第35页 |
| 4.5 PCR产物的清洁回收 | 第35-36页 |
| 4.6 限制性内切酶EcoRⅠ和Xho Ⅰ双酶切5'Flag-pcDNA3.0质粒及)OCT4各截断体的PCR产物 | 第36页 |
| 4.7 双酶切后的OCT4各截断体产物和5'Flag-pcDNA3.0质粒的清洁回收(此步骤同于4.5) | 第36-37页 |
| 4.8 清洁回收后OCT4各截断体产物和对应5'Flag-pcDNA3.0质粒的连接 | 第37页 |
| 4.9 大肠杆菌DH5α感受态细菌的制备 | 第37-38页 |
| 4.10 重组质粒的转化和筛选 | 第38页 |
| 4.11 重组质粒的PCR鉴定 | 第38-39页 |
| 4.12 取出PCR鉴定呈阳性的菌液,抽提质粒 | 第39页 |
| 4.13 DNA测序鉴定 | 第39-40页 |
| 4.14 重组突变质粒Flag-OCT4 K118R、K121R、K133R、K137R、K144R、K147R、K149R、K170R、K188R、K192R、K199R、K215R的构建 | 第40-41页 |
| 4.15 点突变质粒瞬时转染293T细胞 | 第41页 |
| 4.16 检测重组质粒在细胞内的表达(Western Blot法如前述) | 第41页 |
| 4.17 RNA逆转录合成CDNA反转录反应体系 | 第41-42页 |
| 4.18 细胞内ATP水平检测 | 第42页 |
| 4.19 细胞内Cyt C活性检测 | 第42-43页 |
| 4.20 数据统计分析 | 第43-44页 |
| 5. 实验结果 | 第44-46页 |
| 5.1 OCT4与STAT3的结合依赖OCT4第144位赖氨酸位点 | 第44页 |
| 5.2 OCT4与STAT3在细胞质基质结合后抑制STAT3进线粒体 | 第44页 |
| 5.3 OCT4使STAT3与Cytc结合减少 | 第44-45页 |
| 5.4 肿瘤细胞内OCT4抑制高表达的STAT3进线粒体,使CytC活性降低ATP生成量减少 | 第45-46页 |
| 6. 附图 | 第46-51页 |
| 7. 讨论 | 第51-52页 |
| 8. 结论 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-56页 |
| 致谢 | 第56-57页 |
| 硕士在读期间发表的论文目录 | 第57-58页 |
| 论文评阅及答辩情况表 | 第58页 |
