| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-10页 |
| 第1章 文献综述 | 第10-19页 |
| ·海洋鱼类细菌性病原的防治 | 第10-12页 |
| ·海洋鱼类细菌性病原 | 第10-11页 |
| ·海洋鱼类细菌性病原的防治策略 | 第11-12页 |
| ·细胞穿膜肽在疫苗开发中的应用 | 第12-15页 |
| ·细胞穿膜肽的概况 | 第12页 |
| ·细胞穿膜肽的入胞途径和穿膜机制研究 | 第12-13页 |
| ·细胞穿膜肽在疫苗开发中的应用 | 第13-15页 |
| ·重组载体疫苗表达系统 | 第15-18页 |
| ·诱导型启动子 | 第16-17页 |
| ·细菌性病原迟钝爱德华氏菌保护性抗原F1gD及GAPDH | 第17-18页 |
| ·本课题研究内容与意义 | 第18-19页 |
| 第2章 穿膜肽与EGFP融合基因的克隆,蛋白表达及纯化 | 第19-35页 |
| ·引言 | 第19页 |
| ·实验材料 | 第19-22页 |
| ·药品、试剂及设备 | 第19页 |
| ·菌株、质粒及引物 | 第19-21页 |
| ·常用培养基 | 第21-22页 |
| ·实验方法 | 第22-28页 |
| ·细菌培养与菌种保藏 | 第22-23页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第23页 |
| ·大肠杆菌的钙转化 | 第23页 |
| ·细菌质粒提取 | 第23-24页 |
| ·DNA的琼脂糖凝胶电泳 | 第24页 |
| ·酶切产物纯化及DNA电泳胶回收 | 第24页 |
| ·PCR实验 | 第24-25页 |
| ·大肠杆菌胞内重组蛋白的表达 | 第25-26页 |
| ·重组蛋白的分离纯化 | 第26页 |
| ·细胞穿膜肽筛选及分析 | 第26-28页 |
| ·结果与讨论 | 第28-33页 |
| ·基于文献确定候选穿膜肽 | 第28页 |
| ·CPPs-EGFP融合表达系统的构建 | 第28-31页 |
| ·CPPs-EGFP融合蛋白的荧光表达及检测 | 第31-33页 |
| ·CPPs-EGFP融合蛋白的分离纯化 | 第33页 |
| ·本章小结 | 第33-35页 |
| 第3章 在细胞模型上考察CPPs与EGFP融合蛋白的穿膜效果 | 第35-44页 |
| ·引言 | 第35页 |
| ·实验材料 | 第35-36页 |
| ·药品、试剂及设备 | 第35页 |
| ·细胞株以及纯化蛋白 | 第35-36页 |
| ·细胞培养基 | 第36页 |
| ·实验方法 | 第36-38页 |
| ·细胞培养 | 第36页 |
| ·细胞密度测定 | 第36页 |
| ·CPPs-EGFP融合蛋白同J774A.1细胞的共孵育 | 第36-37页 |
| ·CPPs-EGFP融合蛋白同EPC细胞的共孵育 | 第37页 |
| ·徕卡DMI 3000B倒置荧光显微镜观察 | 第37页 |
| ·共聚焦显微镜观察 | 第37页 |
| ·流式细胞仪检测胞内蛋白 | 第37-38页 |
| ·结果与讨论 | 第38-43页 |
| ·CPPs-EGFP融合蛋白在J774A.1细胞中的定位情况 | 第38-41页 |
| ·流式细胞仪检测J774A.1胞内的穿膜蛋白 | 第41页 |
| ·CPPs-EGFP融合蛋白在EPC细胞中的定位情况 | 第41-43页 |
| ·本章小结 | 第43-44页 |
| 第4章 FlgD-CPPs孵育巨噬细胞诱导免疫因子的差异表达分析 | 第44-51页 |
| ·引言 | 第44页 |
| ·实验材料 | 第44-45页 |
| ·药品、试剂及设备 | 第44页 |
| ·细胞株、菌株、质粒及引物 | 第44-45页 |
| ·常用培养基 | 第45页 |
| ·实验方法 | 第45-46页 |
| ·细菌、细胞培养及保藏 | 第45页 |
| ·FlgD-CPPs融合抗原表达载体的构建 | 第45页 |
| ·FlgD-CPPs融合抗原的表达及纯化 | 第45页 |
| ·FlgD-CPPs融合抗原蛋白孵育巨噬细胞J774A.1 | 第45-46页 |
| ·巨噬细胞的RNA抽提及逆转录 | 第46页 |
| ·RT-qPCR测定相关免疫因子的差异表达 | 第46页 |
| ·结果与讨论 | 第46-50页 |
| ·FlgD-CPPs融合抗原表达系统的构建,蛋白表达与纯化 | 第46-49页 |
| ·RT-qPCR分析相关免疫因子的差异表达 | 第49-50页 |
| ·本章小结 | 第50-51页 |
| 第5章 在斑马鱼中评价重组大肠杆菌载体疫苗的效果 | 第51-60页 |
| ·引言 | 第51页 |
| ·实验材料 | 第51-52页 |
| ·菌株、质粒及引物 | 第51-52页 |
| ·药品与试剂 | 第52页 |
| ·常规培养基 | 第52页 |
| ·实验动物 | 第52页 |
| ·实验方法 | 第52-54页 |
| ·细菌培养与保藏 | 第52-53页 |
| ·双质粒介导的重组大肠杆菌载体表达系统的构建 | 第53页 |
| ·体外考察重组大肠杆菌载体荧光表达及释放系统 | 第53页 |
| ·重组载体疫苗对斑马鱼的免疫与攻毒 | 第53-54页 |
| ·结果与讨论 | 第54-59页 |
| ·体外考察重组大肠杆菌载体荧光表达及释放系统 | 第54-56页 |
| ·重组载体疫苗的构建 | 第56-57页 |
| ·重组载体疫苗对斑马鱼免疫效果的测定 | 第57-59页 |
| ·本章小结 | 第59-60页 |
| 第6章 总结与展望 | 第60-63页 |
| ·总结 | 第60-61页 |
| ·展望 | 第61-63页 |
| 参考文献 | 第63-68页 |
| 致谢 | 第68页 |
