| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-24页 |
| 1 病原学特点 | 第13-17页 |
| ·细胞学特性 | 第13-14页 |
| ·生物学特性 | 第14-17页 |
| ·Mhp基因的研究 | 第14-15页 |
| ·蛋白抗原基因 | 第15-17页 |
| ·P36蛋白 | 第15页 |
| ·P46蛋白 | 第15-16页 |
| ·P65蛋白 | 第16页 |
| ·P97蛋白 | 第16页 |
| ·P110蛋白 | 第16-17页 |
| 2 流行病学 | 第17-18页 |
| 3 致病机理 | 第18页 |
| 4 诊断学方法 | 第18-22页 |
| ·病原分离培养 | 第18-19页 |
| ·清学诊断方法 | 第19页 |
| ·免疫荧光技术 | 第19页 |
| ·间接血凝试验、补体结合试验、ELISA试验 | 第19页 |
| ·分子生物学诊断方法 | 第19-22页 |
| ·核酸探针 | 第20页 |
| ·PCR检测 | 第20-22页 |
| 5 问题及展望 | 第22-24页 |
| 第二章 猪肺炎支原体荧光定量PCR检测方法的建立 | 第24-44页 |
| 1 材料 | 第24-26页 |
| ·菌株及质粒载体 | 第24-25页 |
| ·主要试剂 | 第25页 |
| ·主要仪器 | 第25页 |
| ·主要溶液配方 | 第25-26页 |
| 2 方法 | 第26-33页 |
| ·引物设计与合成 | 第26页 |
| ·常规PCR Mhp P97 F/R引物 | 第26页 |
| ·Real-time PCR Mhp P97 real F/R引物及探针 | 第26页 |
| ·猪肺炎支原体的培养 | 第26页 |
| ·Mhp模板的制备 | 第26-27页 |
| ·Mhp P97基因的PCR扩增 | 第27-28页 |
| ·目的基因的回收 | 第28页 |
| ·Mhp P97基因与pMD18-T载体连接 | 第28-29页 |
| ·连接产物的转化 | 第29页 |
| ·重组质粒DNA的提取、鉴定及测序 | 第29-31页 |
| ·质粒的提取 | 第29-30页 |
| ·PCR鉴定 | 第30页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第30页 |
| ·重组质粒的测序鉴定 | 第30-31页 |
| ·荧光定量PCR检测方法的建立 | 第31-33页 |
| ·猪肺炎支原体模板的提取(水煮法) | 第31页 |
| ·Taqman Real-Time PCR反应体系及反应条件 | 第31页 |
| ·含猪肺炎支原体P97质粒的拷贝数计算 | 第31页 |
| ·猪肺炎支原体P97定量PCR方法的建立 | 第31-33页 |
| ·标准曲线的建立 | 第32页 |
| ·敏感性试验 | 第32页 |
| ·特异性试验 | 第32-33页 |
| ·各菌株模板的提取 | 第32-33页 |
| ·反转录cDNA的合成 | 第33页 |
| ·重复性试验 | 第33页 |
| 3 结果与分析 | 第33-41页 |
| ·猪肺炎支原体P97常规PCR退火温度的优化 | 第33-34页 |
| ·猪肺炎支原体P97片段扩增结果 | 第34-35页 |
| ·猪肺炎支原体P97片段回收结果 | 第35页 |
| ·重组质粒pMD18-T/P97的鉴定 | 第35-37页 |
| ·重组质粒pMD18-T/P97的PCR鉴定 | 第35-36页 |
| ·重组质粒pMD18-T/P97的酶切鉴定 | 第36-37页 |
| ·质粒测序结果 | 第37页 |
| ·标准曲线的建立 | 第37-39页 |
| ·敏感性的检测 | 第39-40页 |
| ·特异性检测 | 第40页 |
| ·重复性检测 | 第40-41页 |
| 4 讨论 | 第41-42页 |
| 5 小结 | 第42-44页 |
| 第三章 猪肺炎支原体实时荧光定量PCR探针方法的应用 | 第44-58页 |
| 1 材料 | 第44-45页 |
| ·菌种及组织材料 | 第44-45页 |
| ·主要试剂 | 第45页 |
| ·主要仪器设备 | 第45页 |
| ·试剂配方 | 第45页 |
| 2 方法 | 第45-49页 |
| ·PCR反应中引物的设计及合成 | 第45-46页 |
| ·Real-time PCR Mhp P97 real F/R引物及探针 | 第45页 |
| ·套式PCR引物的设计与合成 | 第45-46页 |
| ·猪肺炎支原体的培养(同第二章2.2) | 第46页 |
| ·含猪肺炎支原体P97片段的质粒的提取(同第二章2.8.1) | 第46页 |
| ·猪肺炎支原体模板的提取 | 第46-47页 |
| ·猪肺炎支原体NJ株菌液模板的提取 | 第46页 |
| ·攻毒猪肺炎支原体的猪各部分组织DNA的提取 | 第46页 |
| ·攻毒Mhp的猪各部分组织DNA的提取(同第三章2.4.2) | 第46-47页 |
| ·病变猪肺组织及样品组织DNA的提取(同第三章2.4.2) | 第47页 |
| ·Taqman Real-Time PCR反应体系及反应条件 | 第47页 |
| ·套式PCR反应体系及反应条件 | 第47-48页 |
| ·TaqMan荧光定量PCR检测临床样品 | 第48-49页 |
| ·检测灭活对猪肺炎支原体的影响 | 第48页 |
| ·检测攻毒Mhp猪不同部位的Mhp含量变化 | 第48页 |
| ·比较荧光定量PCR与套式PCR检测猪肺组织的Mhp检出率 | 第48-49页 |
| ·检测江苏省某猪场中不同猪感染Mhp程度 | 第49页 |
| 3 结果与分析 | 第49-55页 |
| ·检测灭活前后猪肺炎支原体菌液中Mhp含量变化 | 第49-50页 |
| ·猪肺炎支原体在攻毒猪不同组织中的分布 | 第50-51页 |
| ·比较荧光定量PCR与套式PCR检测猪肺组织的敏感性 | 第51-53页 |
| ·检测猪场病变猪肺组织中Mhp含量 | 第53-55页 |
| 4 讨论 | 第55-57页 |
| ·检测灭活前后Mhp菌体中Mhp含量 | 第55页 |
| ·检测攻毒Mhp猪体内Mhp的分布 | 第55-56页 |
| ·比较荧光定量PCR与套式PCR检测的意义 | 第56页 |
| ·检测猪场中感染Mhp情况的意义 | 第56-57页 |
| 5 小结 | 第57-58页 |
| 全文总结 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-64页 |
| 致谢 | 第64页 |
