嗜热脂肪酶NC-loop对催化活性、稳定性和趋异进化的作用
| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-14页 |
| 第1章 前言 | 第14-44页 |
| ·Loop 简介 | 第14-21页 |
| ·Loop 简介 | 第14页 |
| ·Loop 的作用 | 第14-18页 |
| ·Loop 在酶功能中的作用 | 第15-17页 |
| ·Loop 在酶进化中的作用 | 第17页 |
| ·Loop 与稳定性的关系 | 第17-18页 |
| ·Loop 的研究方法 | 第18-21页 |
| ·物理学方法 | 第18-19页 |
| ·化学方法 | 第19页 |
| ·生物信息学手段 | 第19-20页 |
| ·蛋白质工程方法 | 第20-21页 |
| ·蛋白质稳定性简介 | 第21-24页 |
| ·提高稳定性的策略 | 第21-23页 |
| ·稳定性和活性的共进化 | 第23-24页 |
| ·嗜热脂肪酶 FClip1 简介 | 第24-33页 |
| ·α/β水解酶超家族简介 | 第24-25页 |
| ·脂肪酶简介 | 第25-29页 |
| ·脂肪酶简介 | 第25-27页 |
| ·脂肪酶分类 | 第27-29页 |
| ·脂肪酶第五家族简介 | 第29-31页 |
| ·脂肪酶第五家族简介 | 第29页 |
| ·脂肪酶第五家族相关水解酶 | 第29-31页 |
| ·NC-loop 简介 | 第31-33页 |
| ·NC-loop 的结构特点 | 第31-32页 |
| ·NC-loop 的柔性 | 第32页 |
| ·NC-loop 精确定位催化重要残基 | 第32页 |
| ·NC-loop 参与形成底物结合口袋 | 第32-33页 |
| ·FClip1 简介 | 第33页 |
| ·本论文立题依据 | 第33-34页 |
| ·参考文献 | 第34-44页 |
| 第2章 二级结构的预测和三级结构的模建 | 第44-60页 |
| ·前言 | 第44页 |
| ·实验材料与方法 | 第44-46页 |
| ·网站和软件 | 第44-45页 |
| ·网站 | 第44-45页 |
| ·软件 | 第45页 |
| ·二级结构的预测 | 第45页 |
| ·三级结构的模建和评价 | 第45-46页 |
| ·实验结果及讨论 | 第46-57页 |
| ·二级结构的分析 | 第46-49页 |
| ·服务器 GOR IV 的预测结果 | 第46-47页 |
| ·服务器 Porter 的预测结果 | 第47页 |
| ·服务器 Scratch 的预测结果 | 第47-48页 |
| ·FClip1 的二级结构确定 | 第48-49页 |
| ·三级结构模型的确立 | 第49-54页 |
| ·三级结构的模建结果 | 第49-51页 |
| ·三级结构模型的评价和确立 | 第51-54页 |
| ·三级结构描述和 NC-loop 的结构特征 | 第54-57页 |
| ·FClip1 三级结构描述 | 第54-56页 |
| ·NC-loop 的结构特征 | 第56-57页 |
| ·小结 | 第57-58页 |
| ·参考文献 | 第58-60页 |
| 第3章 NC-loop 在催化过程中的作用 | 第60-86页 |
| ·前言 | 第60页 |
| ·实验方法 | 第60-68页 |
| ·删除和定点突变体的构建 | 第60-63页 |
| ·环化排列突变体的构建 | 第63-65页 |
| ·串联 FClip1 的构建 | 第63-65页 |
| ·环化排列突变体构建 | 第65页 |
| ·组合突变体的构建 | 第65页 |
| ·野生型和突变体的表达和纯化 | 第65-66页 |
| ·圆二色谱 | 第66-67页 |
| ·酯酶活力测定 | 第67页 |
| ·酶动力学常数测定 | 第67页 |
| ·三级结构模型建立 | 第67-68页 |
| ·分子对接 | 第68页 |
| ·实验结果及讨论 | 第68-82页 |
| ·突变体的设计思路 | 第68-70页 |
| ·野生型和突变体的纯度检测 | 第70-71页 |
| ·删除突变对蛋白折叠和二级结构含量的影响 | 第71-73页 |
| ·突变对催化活性和动力学常数的影响 | 第73-79页 |
| ·删除突变对酶活和动力学常数的影响 | 第73-75页 |
| ·Y134 饱和突变对酶活和动力学常数的影响 | 第75-77页 |
| ·丙氨酸扫描突变对酶活和动力学常数的影响 | 第77-78页 |
| ·环化排列对催化活性的影响 | 第78页 |
| ·组合突变对催化活性的影响 | 第78-79页 |
| ·删除突变对底物链长特异性的影响 | 第79-80页 |
| ·分子对接分析 | 第80-82页 |
| ·分子对接简介 | 第80-82页 |
| ·分子对接结果分析 | 第82页 |
| ·小结 | 第82-83页 |
| ·参考文献 | 第83-86页 |
| 第4章 NC-loop 对酶稳定性的调控作用 | 第86-108页 |
| ·前言 | 第86页 |
| ·实验材料与方法 | 第86-91页 |
| ·温度对酶催化活性的影响 | 第86-87页 |
| ·最适温度的测定 | 第86页 |
| ·热失活动力学研究 | 第86-87页 |
| ·圆二色谱（CD）研究蛋白质热解折叠 | 第87-88页 |
| ·差示扫描量热法（DSC）研究热解折叠及其可逆性 | 第88页 |
| ·盐酸胍诱导酶失活的研究 | 第88页 |
| ·荧光色谱研究化学解折叠及其再折叠 | 第88-90页 |
| ·分子动力学模拟（MD） | 第90-91页 |
| ·突变体 C 13 的同源模建 | 第91页 |
| ·实验结果及讨论 | 第91-105页 |
| ·温度对酶催化活性的影响 | 第91-96页 |
| ·删除突变对最适温度的影响 | 第91-92页 |
| ·删除突变对热稳定性的影响 | 第92-93页 |
| ·Y134 饱和突变对热稳定性的影响 | 第93-94页 |
| ·组合突变对热稳定性的影响 | 第94-96页 |
| ·酶的热解折叠及其可逆性研究 | 第96-97页 |
| ·化学稳定性研究 | 第97-100页 |
| ·分子动力学模拟（MD） | 第100-102页 |
| ·活性和稳定性的共进化 | 第102-103页 |
| ·C-末端删除对空间结构的影响 | 第103-105页 |
| ·小结 | 第105-106页 |
| ·参考文献 | 第106-108页 |
| 第5章 NC-loop 潜在的进化意义 | 第108-118页 |
| ·前言 | 第108页 |
| ·实验材料与方法 | 第108-110页 |
| ·软件和数据库 | 第108-109页 |
| ·软件 | 第108页 |
| ·数据库 | 第108-109页 |
| ·NC-loop 统计学分析 | 第109页 |
| ·序列比对和进化树构建 | 第109页 |
| ·过水解酶活性测定 | 第109-110页 |
| ·实验结果及讨论 | 第110-115页 |
| ·NC-loop 的特征和功能 | 第110-114页 |
| ·NC-loop 潜在的进化意义 | 第114-115页 |
| ·小结 | 第115-116页 |
| ·参考文献 | 第116-118页 |
| 创新点 | 第118-120页 |
| 展望 | 第120-122页 |
| 作者简介 | 第122页 |
| 攻读博士期间科研成果 | 第122-124页 |
| 负责或参与的研究课题 | 第124-125页 |
| 致谢 | 第125页 |
