| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 目录 | 第7-10页 |
| 绪论 | 第10-23页 |
| 一 PRAS40的研究进展 | 第10-14页 |
| 1.PRA40的发现 | 第10-11页 |
| 2.PRAS40的序列分析 | 第11-12页 |
| 3.PRAS40的功能 | 第12-14页 |
| ·PRAS40与细胞调亡 | 第12页 |
| ·PRAS40与肿瘤 | 第12-13页 |
| ·PRAS40与信号转导 | 第13-14页 |
| 二.14-3-3的结构及功能 | 第14-21页 |
| ·-3-3的分子特性 | 第15-16页 |
| 2.靶蛋白的结合序列 | 第16-18页 |
| ·磷酸化丝氨酸/苏氨酸识别序列 | 第16-17页 |
| ·典型的磷酸化丝氛酸/苏氨酸序列 | 第16-17页 |
| ·丝氛酸富集型序列 | 第17页 |
| ·其他序列 | 第17页 |
| ·非磷酸化识别序列 | 第17-18页 |
| ·-3-3的调控 | 第18-19页 |
| ·-3-3与信号转导 | 第19-20页 |
| ·-3-3与疾病的关系 | 第20-21页 |
| ·肿瘤 | 第20页 |
| ·神经性疾病 | 第20-21页 |
| 三.PRAS40与14-3-3相互作用的研究 | 第21页 |
| 四、本研究的目的与意义 | 第21-23页 |
| 第一章 14-3-3七种亚型的分离纯化 | 第23-34页 |
| 1.实验材料 | 第23-27页 |
| ·菌株 | 第23页 |
| ·实验仪器 | 第23页 |
| ·实验试剂 | 第23-27页 |
| ·主要试剂 | 第23-24页 |
| ·主要试剂配制方法 | 第24-27页 |
| ·His-14-3-3融合蛋白的诱导表达试剂 | 第24页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第24-25页 |
| ·Western Blot | 第25页 |
| ·His-Ni~(2+)亲和层析 | 第25-27页 |
| 2.实验流程图 | 第27页 |
| 3.实验方法 | 第27-30页 |
| ·感受态大肠杆菌BL21的制备及质粒的转化 | 第27-28页 |
| ·感受态大肠杆菌BL21的制备 | 第27页 |
| ·质粒的转化 | 第27-28页 |
| ·融合蛋白的表达 | 第28页 |
| ·菌体的超声破碎(整个过程应在4℃下完成) | 第28页 |
| ·融合蛋白的纯化 | 第28-29页 |
| ·His-tag beads的处理 | 第28-29页 |
| ·His-tag亲和层析(始终将操作温度控制在4℃) | 第29页 |
| ·SDS-PAGE | 第29-30页 |
| ·配胶 | 第29-30页 |
| ·电泳 | 第30页 |
| ·纯化后的蛋白的保存 | 第30页 |
| 4.实验结果 | 第30-32页 |
| ·-3-3七种亚型的表达 | 第30-32页 |
| ·SDS-PAGE检测His-14-3-3融合蛋白的纯化 | 第32页 |
| 5.讨论 | 第32-34页 |
| 第二章 PRAS40的分离纯化 | 第34-44页 |
| 材料与方法 | 第34-42页 |
| ·材料 | 第34-37页 |
| ·菌株 | 第34页 |
| ·实验仪器 | 第34-35页 |
| ·实验试剂(主要) | 第35页 |
| ·主要试剂配制 | 第35-37页 |
| ·PRAS40融合蛋白诱导表达 | 第35页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第35-36页 |
| ·免疫印迹 | 第36页 |
| ·GST融合蛋白分离纯化 | 第36-37页 |
| ·GST-PRAS40融合蛋白表达和分离纯化实验流程 | 第37页 |
| ·实验方法 | 第37-42页 |
| ·感受态大肠杆菌BL21的制备及质粒的转化 | 第37-38页 |
| ·感受态大肠杆菌BL21的制备 | 第37页 |
| ·质粒的转化 | 第37-38页 |
| ·PRAS40融合蛋白诱导表达 | 第38页 |
| ·菌体破碎 | 第38页 |
| ·GST融合蛋白分离纯化 | 第38-39页 |
| ·纯化GST融合蛋白鉴定 | 第39-42页 |
| ·样品的制备 | 第39页 |
| ·SDS-PAGE电泳鉴定 | 第39-40页 |
| ·GST-PRAS40融和蛋白western blot鉴定 | 第40-42页 |
| 实验结果与讨论 | 第42-43页 |
| 1.实验结果 | 第42-43页 |
| ·GST-PRAS40融合蛋白的诱导鉴定 | 第42页 |
| ·GST-PRAS40融合蛋白的表达和纯化 | 第42-43页 |
| ·GST-PRAS40融合蛋白western-blot鉴定 | 第43页 |
| 结果讨论 | 第43-44页 |
| 第三章 利用GATEWAY构建pJG-PRAS40和pEG-PRAS40 | 第44-49页 |
| 1、材料 | 第44-46页 |
| ·主要试剂及配制 | 第44-45页 |
| ·主要仪器、设备 | 第45-46页 |
| 2.方法 | 第46页 |
| 3.结果与分析 | 第46-48页 |
| ·attB-PRAS40基因的PCR扩增 | 第46-47页 |
| ·PRAS40质粒的构建及鉴定 | 第47-48页 |
| 4.讨论 | 第48-49页 |
| 第四章 PRAS40和14-3-3相互作用的酵母双杂交检测 | 第49-61页 |
| 材料与方法 | 第49-61页 |
| 1.实验材料 | 第49-54页 |
| ·菌种 | 第49-50页 |
| ·质粒 | 第50页 |
| ·实验所用试剂 | 第50-51页 |
| ·主要实验仪器 | 第51页 |
| ·实验所用各种培养基配方及试剂配方 | 第51-53页 |
| ·试剂盒 | 第53-54页 |
| 2.实验流程图 | 第54页 |
| 3.实验方法 | 第54-57页 |
| ·感受态大肠感菌的制备 | 第54页 |
| ·质粒的转化 | 第54-55页 |
| ·菌种保存 | 第55页 |
| ·质粒的抽提 | 第55-56页 |
| ·质粒的琼脂糖电泳鉴定 | 第56页 |
| ·酵母的共转染双杂交实验 | 第56-57页 |
| ·x-gal显色反应 | 第57页 |
| 4.实验结果 | 第57-60页 |
| ·质粒的琼脂糖电泳 | 第57-58页 |
| ·PRAS40与14-3-3各亚型双杂交分析 | 第58-60页 |
| ·设pEG-PRAS40与pJG-14-3-3各亚型质粒为实验组,pEG-Ask1与pJG-zeta | 第58页 |
| ·设pEG-14-3-3各亚型与pJG-PRAS40为实验组,pEG-202与pJG-PRAS40为空白对照,阳性与阴性对照不变,也得到了类似的结果且,在x-gal板上显色反应结果与图2相似。 | 第58-60页 |
| 5.讨论 | 第60-61页 |
| 总结 | 第61-63页 |
| 1.本论文的创新之处 | 第61页 |
| 2.进一步研究计划 | 第61-63页 |
| 参考文献 | 第63-68页 |
| 附录:英文缩略词表(English abbreviations) | 第68-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
| 攻读硕士期间已(待)发表的论文 | 第70-71页 |
| 个人简历 | 第71页 |
