| 中文摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-17页 |
| 第一章 引言 | 第17-34页 |
| 第一节 木聚糖酶的结构与功能 | 第17-28页 |
| 1 木聚糖酶(Xylanase)的分类及结构区域 | 第17-19页 |
| ·木聚糖酶的分类 | 第17-18页 |
| ·木聚糖酶的结构区域 | 第18-19页 |
| 2 木聚糖酶的催化机制 | 第19-20页 |
| 3 木聚糖酶分子结构与重要酶学性质关系的研究进展 | 第20-27页 |
| ·木聚糖酶的催化残基 | 第20-22页 |
| ·木聚糖酶的热稳定性 | 第22-25页 |
| ·热稳定区(TSD) | 第22-23页 |
| ·盐桥(Salt bridge) | 第23页 |
| ·二硫键(Disulfide bridge) | 第23页 |
| ·芳香族氨基酸 | 第23-24页 |
| ·蛋白质表面精氨酸和脯氨酸的含量 | 第24页 |
| ·一些保守的氨基酸 | 第24-25页 |
| ·木聚糖酶的最适pH和pI | 第25-26页 |
| ·木聚糖酶的底物结合区 | 第26-27页 |
| 4 问题与展望 | 第27-28页 |
| 第二节 DNA改组(DNA shuffling)技术简介 | 第28-33页 |
| 1 DNA改组的原理 | 第28页 |
| 2 DNA改组技术的发展 | 第28-30页 |
| 3 DNA改组技术的成果 | 第30-31页 |
| 4 DNA改组的应用前景 | 第31-33页 |
| 本研究的目的和意义 | 第33-34页 |
| 第二章 木聚糖酶XYNB热稳定性的分子改良 | 第34-69页 |
| 1 实验材料 | 第34-36页 |
| ·菌种和质粒 | 第34页 |
| ·工具酶 | 第34页 |
| ·试剂 | 第34-35页 |
| ·培养基 | 第35-36页 |
| ·主要仪器 | 第36页 |
| 2 研究方法 | 第36-46页 |
| ·木聚糖酶XYNB的同源建模 | 第36页 |
| ·突变位点的确定 | 第36-37页 |
| ·突变方法 | 第37-39页 |
| ·Over lapping PCR程序 | 第37-38页 |
| ·两步PCR程序 | 第38页 |
| ·突变试剂盒程序 | 第38页 |
| ·突变引物 | 第38-39页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第39页 |
| ·pET22b(+)-xynB'表达载体(xynB'指任意突变酶基因) | 第39页 |
| ·pPIC9-xynB'表达载体 | 第39页 |
| ·重组木聚糖酶的表达及纯化 | 第39-43页 |
| ·在大肠杆菌中的诱导表达 | 第40页 |
| ·在毕赤酵母中的表达 | 第40-42页 |
| ·酵母感受态的制备 | 第40页 |
| ·酵母细胞的转化 | 第40-41页 |
| ·转化子的筛选 | 第41页 |
| ·目的基因在毕赤酵母中的表达检测 | 第41页 |
| ·发酵罐水平重组酵母的高细胞密度发酵 | 第41-42页 |
| ·重组酶的Western Blot分析 | 第42-43页 |
| ·SDS-PAGE | 第42页 |
| ·Western Blot | 第42-43页 |
| ·重组木聚糖酶的纯化 | 第43页 |
| ·木聚糖酶活性的测定 | 第43-44页 |
| ·酶活单位定义 | 第43页 |
| ·木糖(Xylose)标准曲线的绘制 | 第43-44页 |
| ·木聚糖酶活性测定的方法 | 第44页 |
| ·酶学性质的分析与比较 | 第44-46页 |
| ·木聚糖酶最适pH和pH稳定性的测定 | 第44页 |
| ·木聚糖酶最适反应温度和热稳定性的测定 | 第44-45页 |
| ·金属离子和相关化学试剂对木聚糖酶活性的影响 | 第45页 |
| ·木聚糖酶反应初速度的测定 | 第45页 |
| ·木聚糖酶km和Vmax值的测定 | 第45页 |
| ·木聚糖酶比活性的测定 | 第45-46页 |
| ·标准曲线的绘制 | 第45-46页 |
| ·比活性测定 | 第46页 |
| ·纤维素酶活性的测定 | 第46页 |
| ·木聚糖酶抗胃蛋白酶及胰蛋白酶的能力 | 第46页 |
| 3 结果 | 第46-63页 |
| ·T11Y定点突变 | 第46-51页 |
| ·同源建模及突变位点的确定 | 第46-47页 |
| ·定点突变 | 第47页 |
| ·重组表达质粒的构建 | 第47-48页 |
| ·重组木聚糖酶T11Y的表达纯化 | 第48-49页 |
| ·T11Y在大肠杆菌中的表达 | 第48页 |
| ·T11Y在毕赤酵母中的表达 | 第48-49页 |
| ·木聚糖酶T11Y的纯化 | 第49页 |
| ·T11Y酶学性质的分析与比较 | 第49-51页 |
| ·N13D、S40E定点突变 | 第51-54页 |
| ·同源建模及突变位点的确定 | 第51-52页 |
| ·定点突变 | 第52页 |
| ·重组表达质粒的构建 | 第52页 |
| ·重组木聚糖酶N13D、S40E的表达纯化 | 第52页 |
| ·N13D、S40E酶学性质的分析与比较 | 第52-54页 |
| ·木聚糖酶XYNB氨基端的替换 | 第54-60页 |
| ·同源建模及突变位点的确定 | 第54-55页 |
| ·木聚糖酶融合基因tb的构建 | 第55-56页 |
| ·重组表达质粒的构建 | 第56页 |
| ·重组木聚糖酶TB的表达纯化 | 第56-57页 |
| ·TB在大肠杆菌中的表达 | 第56-57页 |
| ·TB在毕赤酵母中的表达 | 第57页 |
| ·木聚糖酶TB的纯化 | 第57-58页 |
| ·TB酶学性质的分析与比较 | 第58-60页 |
| ·XYNB及TB的二硫键突变 | 第60-63页 |
| ·同源建模及突变位点的确定 | 第60页 |
| ·突变位点的引入 | 第60页 |
| ·重组表达质粒的构建 | 第60-61页 |
| ·重组木聚糖酶XS和TS的表达纯化及二硫键的分析 | 第61-62页 |
| ·重组木聚糖酶XS和TS的表达纯化 | 第61页 |
| ·二硫键的分析 | 第61-62页 |
| ·XS和TS酶学性质的分析与比较 | 第62-63页 |
| 4 讨论 | 第63-68页 |
| ·T11Y定点突变 | 第64页 |
| ·N13D、S40E定点突变 | 第64-65页 |
| ·木聚糖酶XYNB氨基端的替换 | 第65-67页 |
| ·XYNB及TB的二硫键突变 | 第67-68页 |
| 5 小结 | 第68-69页 |
| 第三章 木聚糖酶XYNB催化残基的研究及最适pH值的分子改良 | 第69-78页 |
| 1 实验材料 | 第69页 |
| 2 研究方法 | 第69-70页 |
| ·突变位点的确定 | 第69页 |
| ·定点突变方法 | 第69-70页 |
| ·E87F和E177F定点突变 | 第69页 |
| ·N46D定点突变 | 第69-70页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第70页 |
| ·重组木聚糖酶的表达及纯化 | 第70页 |
| ·酶学性质的分析与比较 | 第70页 |
| 3 结果 | 第70-76页 |
| ·突变位点的确定 | 第70-72页 |
| ·定点突变 | 第72页 |
| ·重组表达质粒的构建 | 第72页 |
| ·重组木聚糖酶的表达及纯化 | 第72-74页 |
| ·在大肠杆菌中的表达 | 第72-73页 |
| ·在毕赤酵母中的表达 | 第73-74页 |
| ·木聚糖酶N46D的纯化 | 第74页 |
| ·酶学性质的分析与比较 | 第74-76页 |
| 4 讨论 | 第76-78页 |
| 第四章 木聚糖酶XYNB的定向改良——DNA shuffling方法 | 第78-91页 |
| 1 实验材料 | 第78页 |
| ·菌种和质粒 | 第78页 |
| ·工具酶、试剂、培养基及主要仪器 | 第78页 |
| 2 研究方法 | 第78-83页 |
| ·实验设计 | 第78页 |
| ·目的基因片段的扩增 | 第78-79页 |
| ·DNase I的酶切 | 第79页 |
| ·酶切小片段的回收 | 第79页 |
| ·无引物PCR | 第79-80页 |
| ·有引物PCR | 第80页 |
| ·构建突变体库 | 第80-82页 |
| ·双酶切 | 第80页 |
| ·连接 | 第80-81页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第81页 |
| ·大肠杆菌的转化 | 第81-82页 |
| ·连接效率的鉴定 | 第82页 |
| ·突变体重组子在木聚糖平板上的活性筛选 | 第82页 |
| ·有木聚糖酶活性的菌落的筛选 | 第82页 |
| ·热稳定性突变酶的筛选 | 第82页 |
| ·突变酶基因在毕赤酵母中的表达纯化和酶学性质研究 | 第82-83页 |
| 3.结果 | 第83-88页 |
| ·目的基因片段的扩增 | 第83页 |
| ·DNase I的酶切 | 第83页 |
| ·酶切小片段的回收 | 第83-84页 |
| ·无引物PCR | 第84页 |
| ·有引物PCR | 第84-85页 |
| ·构建突变体库 | 第85页 |
| ·突变体重组子在木聚糖平板上的活性筛选 | 第85-86页 |
| ·有木聚糖酶活性的菌落的筛选 | 第85-86页 |
| ·热稳定性突变酶的筛选 | 第86页 |
| ·突变酶基因在毕赤酵母中的表达纯化 | 第86-87页 |
| ·酶学性质研究 | 第87-88页 |
| 4 讨论 | 第88-91页 |
| 第五章 结论 | 第91-93页 |
| 参考文献 | 第93-101页 |
| 致谢 | 第101-102页 |
| 作者简历 | 第102页 |
