| 摘 要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-14页 |
| 第一章、 综述 | 第14-37页 |
| 1. 鱼类 MSTN 基因的研究进展 | 第14-20页 |
| ·鱼类 MSTN 基因的分子结构 | 第15-16页 |
| ·鱼类 MSTN 的不同基因型 | 第16-17页 |
| ·鱼类 MSTN 基因的表达 | 第17-18页 |
| ·不同组织的表达 | 第17-18页 |
| ·不同发育时期的表达 | 第18页 |
| ·鱼类 MSTN 基因的功能分析 | 第18-19页 |
| ·鱼类 MSTN 基因与其他基因的互作关系 | 第19页 |
| ·鱼类 MSTN 基因的微卫星标记及多态性 | 第19-20页 |
| ·MSTN 基因研究的意义及前景展望 | 第20页 |
| 2. 鱼类胚胎干细胞及其介导的遗传操作研究进展 | 第20-25页 |
| ·斑马鱼胚胎干细胞 | 第22-23页 |
| ·青鳉胚胎干细胞 | 第23-24页 |
| ·金鲷胚胎干细胞 | 第24页 |
| ·花鲈和真鲷胚胎干细胞 | 第24-25页 |
| ·大菱鲆胚胎干细胞 | 第25页 |
| 3. 基因打靶技术的发展及操作方法 | 第25-34页 |
| ·基因打靶技术的原理 | 第25-26页 |
| ·Holliday 双链侵入模型 | 第25-26页 |
| ·单链侵入模型 | 第26页 |
| ·双链断裂修复模型 | 第26页 |
| ·基因打靶技术的操作方法 | 第26-34页 |
| ·同源重组载体构建 | 第27-31页 |
| ·基因打靶载体的类型 | 第27-29页 |
| ·基因打靶载体构建的策略 | 第29-31页 |
| ·打靶载体转化受体细胞的方法 | 第31-32页 |
| ·磷酸钙共沉淀法 | 第31-32页 |
| ·脂质体法 | 第32页 |
| ·电穿孔法 | 第32页 |
| ·同源重组阳性细胞的筛选 | 第32-34页 |
| ·正向选择法(positive selection) | 第32-33页 |
| ·正负选择法(positive and negative selection) | 第33-34页 |
| ·同源重组的胚胎干细胞克隆的鉴定方法 | 第34页 |
| ·PCR 初步鉴定重组阳性细胞 | 第34页 |
| ·SOURTHERN BLOT 鉴定重组阳性细胞 | 第34页 |
| ·同源重组阳性细胞向受体细胞的移植 | 第34页 |
| 4. 鱼类基因打靶潜在的应用价值 | 第34-37页 |
| ·鱼类基因功能分析的平台 | 第35页 |
| ·提高鱼类的抗病力或生长 | 第35-36页 |
| ·鱼类 MSTN 打靶研究的应用前景 | 第36-37页 |
| 第二章、花鲈肌肉生长抑素（MSTN）基因的克隆和进化分析 | 第37-52页 |
| 1. 材料和试剂 | 第38页 |
| ·实验材料 | 第38页 |
| ·实验试剂 | 第38页 |
| 2 实验方法 | 第38-43页 |
| ·花鲈基因组 DNA 的提取 | 第38页 |
| ·花鲈肌肉生长抑制基因（MSTN）编码区序列的扩增 | 第38-39页 |
| ·染色体步移克隆花鲈MSTN基因5’和3’侧翼序列 | 第39-42页 |
| ·染色体步移扩增引物 | 第39-40页 |
| ·花鲈基因组 DNA 的内切酶的完全消化 | 第40页 |
| ·接头(Cassette)的连接反应 | 第40-41页 |
| ·BD GenomeWalker~(TM) Universal Kit 扩增MSTN 5’-UTR 区域 | 第41页 |
| ·LA PCR in vitro Cloning kit 扩增MSTN 3’-UTR 区域 | 第41-42页 |
| ·BD GenomeWalker~(TM) Universal Kit 再次扩增MSTN 3’-UTR 区域 | 第42页 |
| ·PCR 产物的分离、纯化及回收 | 第42页 |
| ·花鲈肌肉生长抑制基因（MSTN）剪接连接点分析 | 第42-43页 |
| ·序列分析和比对 | 第43页 |
| 3 实验结果 | 第43-49页 |
| ·花鲈MSTN基因的克隆及序列测定 | 第43-44页 |
| ·花鲈MSTN基因的结构和序列分析 | 第44-45页 |
| ·花鲈MSTN基因的氨基酸序列比对及同源性分析 | 第45-47页 |
| ·花鲈肌肉生长抑素（MSTN）的进化分析 | 第47-49页 |
| 4 讨论 | 第49-52页 |
| 第三章、花鲈肌肉生长抑素基因（MSTN）的表达分析 | 第52-62页 |
| 1、材料和方法 | 第53-56页 |
| ·实验材料 | 第53页 |
| ·实验试剂及质粒 | 第53页 |
| ·花鲈组织及胚胎的收集 | 第53页 |
| ·花鲈DNA及总RNA的提取 | 第53页 |
| ·表达引物的设计 | 第53-54页 |
| ·反转录第一链cDNA的合成 | 第54页 |
| ·PCR扩增 | 第54页 |
| ·GFP表达载体的构建 | 第54-55页 |
| ·细胞的培养及脂质体介导的细胞转化 | 第55页 |
| ·显微注射 | 第55-56页 |
| 2、实验结果 | 第56-60页 |
| ·MSTN 基因在花鲈不同组织中的表达 | 第56页 |
| ·MSTN 基因在花鲈早期胚胎发育中的表达 | 第56-57页 |
| ·MSTN 基因在不同的细胞系中的表达 | 第57页 |
| ·表达 GFP 载体的构建 | 第57-58页 |
| ·pMSTN-GFP 转化LJE51 细胞后的荧光观察 | 第58-59页 |
| ·pMSTN-GFP 在斑马鱼胚胎中的表达 | 第59-60页 |
| 3. 讨论 | 第60-62页 |
| 第四章、花鲈MSTN 同源重组载体的构建 | 第62-76页 |
| 第一节、花鲈MSTN 基因1.5kb 及3.2kb 同源片段的扩增 | 第62-65页 |
| 1 实验方法 | 第62-65页 |
| ·花鲈MSTN 基因同源重组载体部分片段的引物设计 | 第62-63页 |
| ·花鲈MSTN 基因同源长、短片段的PCR 扩增 | 第63-64页 |
| ·1.5 Kb 同源短片段的扩增 | 第63-64页 |
| ·3.2 Kb 同源长片段的扩增 | 第64页 |
| ·PCR 产物检测及回收 | 第64-65页 |
| 2 实验结果 | 第65页 |
| 第二节 花鲈 MSTN 基因同源重组载体的构建 | 第65-76页 |
| 1 实验材料 | 第65页 |
| 2 实验方法和结果 | 第65-74页 |
| ·重组质粒P+M1.5的构建 | 第65-69页 |
| ·乙醇纯化回收PCR 产物 | 第65-66页 |
| ·酶切 PCR 产物及PBSKII+质粒 | 第66页 |
| ·试剂盒纯化回收酶切产物 | 第66页 |
| ·酶切产物的连接 | 第66-67页 |
| ·连接产物的转化及筛选 | 第67-68页 |
| ·P+M1.5 连接质粒的鉴定 | 第68-69页 |
| ·重组质粒 P+M1.5+M3.2 的构建 | 第69-70页 |
| ·重组质粒P+M1.5+M3.2+neo 的构建(正选择基因的插入) | 第70-73页 |
| ·neo 片段的连接 | 第70-71页 |
| ·重组质粒 P+M1.5+M3.2+neo 的转化、筛选和酶切鉴定 | 第71页 |
| ·重组质粒 P+M1.5+M3.2+neo 的测序鉴定 | 第71-73页 |
| ·重组质粒P+M1.5+M3.2+neo+TK 的构建(负选择基因tk 的插入) | 第73-74页 |
| 3. 讨论 | 第74-76页 |
| 第五章、三种脂质体介导的花鲈胚胎干细胞转化效率的比较研究 | 第76-85页 |
| 1 材料和方法 | 第76-77页 |
| ·质粒的制备 | 第76-77页 |
| ·细胞培养 | 第77页 |
| ·脂质体介导的细胞转化 | 第77页 |
| ·表达检测及表达效率的统计 | 第77页 |
| 2 实验结果 | 第77-82页 |
| ·DNA 与脂质体的比例对转化效率的影响 | 第77-79页 |
| ·DNA与脂质体的剂量对转化效率的影响 | 第79-80页 |
| ·细胞接种时间对转化效率的影响 | 第80-81页 |
| ·细胞接种初始密度对转染效率的影响 | 第81-82页 |
| 3. 讨论 | 第82-85页 |
| 第六章、表达绿色荧光蛋白基因的花鲈胚胎干细胞株的建立及其体外分化 | 第85-94页 |
| 1. 材料和方法 | 第85-87页 |
| ·质粒DNA的制备及细胞培养 | 第85-86页 |
| ·脂质体介导的细胞转化 | 第86页 |
| ·药物筛选 | 第86页 |
| ·基因整合和表达的检测 | 第86页 |
| ·GFP阳性花鲈胚胎干细胞体外分化能力的测定 | 第86-87页 |
| ·GFP阳性花鲈胚胎干细胞形成拟胚体的能力 | 第87页 |
| 2. 实验结果 | 第87-92页 |
| ·表达GFP的LJE51细胞观察、筛选及单克隆阳性细胞株的建立 | 第87-88页 |
| ·GFP+ LJE51细胞的鉴定 | 第88-89页 |
| ·GFP+ LJE51细胞的体外分化能力 | 第89-91页 |
| ·GFP+ LJE51细胞形成拟胚体的能力 | 第91-92页 |
| 3. 讨论 | 第92-94页 |
| 第七章、MSTN 同源重组载体的筛选 | 第94-98页 |
| 1 材料和方法 | 第94-95页 |
| ·实验试剂配制 | 第94页 |
| ·细胞培养 | 第94页 |
| ·MSTN 同源重组载体 DNA 的制备及酶切 | 第94页 |
| ·MSTN 同源重组载体 DNA 转化花鲈 ES 细胞 | 第94页 |
| ·正-负选择效果的检测 | 第94-95页 |
| 2. 实验结果 | 第95-96页 |
| 3. 讨 论 | 第96-98页 |
| 结论 | 第98-100页 |
| 参考文献 | 第100-114页 |
| 致谢 | 第114-115页 |
| 附录：主要成果和发表相关论文 | 第115-116页 |
