| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 第1章 文献综述 | 第10-19页 |
| 1．1 SARS病毒概述 | 第10-13页 |
| 1．1．1 冠状病毒的特点 | 第10-12页 |
| 1．1．2 SARS-CoV的基因结构和功能 | 第12页 |
| 1．1．3 SARS-CoV的变异特性 | 第12-13页 |
| 1．2 冠状病毒受体简介 | 第13-17页 |
| 1．2．1 Ⅰ型冠状病毒受体 | 第13页 |
| 1．2．2 Ⅱ型冠状病毒受体 | 第13-14页 |
| 1．2．3 Ⅲ型冠状病毒受体 | 第14页 |
| 1．2．4 SARS冠状病毒的受体 | 第14-17页 |
| 1．2．4．1 SARS S蛋白的ACE2结合位点 | 第15-16页 |
| 1．2．4．2 ACE2介导的病毒复制 | 第16-17页 |
| 1．3 噬菌体展示技术的优越性 | 第17-19页 |
| 第2章 SARS-CoV受体 ACE2在巴斯德毕赤酵母中的表达 | 第19-32页 |
| 2．1 研究目的和意义 | 第19页 |
| 2．2 材料和方法 | 第19-28页 |
| 2．2．1 材料 | 第19-23页 |
| 2．2．2 实验方法 | 第23-28页 |
| 2．2．2．1 RT-PCR扩增与检测 | 第23-24页 |
| 2．2．2．2 RT-PCR产物的回收与纯化 | 第24页 |
| 2．2．2．3 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第24页 |
| 2．2．2．4 连接产物的转化 | 第24-25页 |
| 2．2．2．5 重组质粒的快速鉴定 | 第25页 |
| 2．2．2．6 质粒的制备 | 第25-26页 |
| 2．2．2．7 酵母菌的转化(LiCl法) | 第26页 |
| 2．2．2．8 酵母重组基因组的提取(PCR模板制备) | 第26-27页 |
| 2．2．2．9 酵母的少量诱导表达 | 第27页 |
| 2．2．2．10 SDS-PAGE电泳 | 第27页 |
| 2．2．2．11 Dot-blot分析 | 第27页 |
| 2．2．2．12 蛋白质凝胶银染(郭尧君，1991) | 第27页 |
| 2．2．2．13 酵母菌株的保存 | 第27-28页 |
| 2．3 结果与分析 | 第28-31页 |
| 2．3．1 PCR产物的克隆 | 第28页 |
| 2．3．2 酵母表达质粒p9K-ACE2A、p9K-ACE2B的构建 | 第28页 |
| 2．3．3 p9K-ACE2A、p9K-ACE2B重组入酵母染色体的 PCR鉴定 | 第28-30页 |
| 2．3．4 重组酵母菌上清的 SDS-PAGE及斑点杂交鉴定 | 第30-31页 |
| 2．4 讨论 | 第31-32页 |
| 第3章 SARS病毒受体 ACE2的克隆、原核表达及其功能区的鉴定 | 第32-42页 |
| 3．1 研究的目的意义 | 第32页 |
| 3．2 材料和方法 | 第32-37页 |
| 3．2．1 材料 | 第32-34页 |
| 3．2．2 实验方法 | 第34-37页 |
| 3．2．2．1 RT-PCR扩增与检测 | 第34页 |
| 3．2．2．2 RT-PCR产物的回收与纯化 | 第34页 |
| 3．2．2．3 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第34页 |
| 3．2．2．4 连接产物的转化 | 第34-35页 |
| 3．2．2．5 重组质粒的快速鉴定 | 第35页 |
| 3．2．2．6 质粒的制备 | 第35页 |
| 3．2．2．7 诱导表达 | 第35页 |
| 3．2．2．8 包涵体提取 | 第35页 |
| 3．2．2．9 可溶性表达产物的提取 | 第35页 |
| 3．2．2．10 不可溶性表达产物(包涵体)的溶解和复性 | 第35页 |
| 3．2．2．11 Westcrn blot | 第35-36页 |
| 3．2．2．12 ACE2与S1蛋白结合的免疫印迹分析 | 第36-37页 |
| 3．3 结果与分析 | 第37-40页 |
| 3．3．1 ACE2A、ACE2B基因的PCR扩增、克隆及表达载体的构建 | 第37-38页 |
| 3．3．2 ACE2A、ACE2B的不同诱导时间的表达情况 | 第38-39页 |
| 3．3．3 表达产物的检测及鉴定 | 第39页 |
| 3．3．4 蛋白的纯化 | 第39页 |
| 3．3．5 ACE2A蛋白与S1蛋白的结合 | 第39-40页 |
| 3．4 讨论 | 第40-42页 |
| 第4章 应用噬菌体展示技术预测 SARS-CoV S蛋白的功能区 | 第42-50页 |
| 4．1 研究的目的意义 | 第42页 |
| 4．2 材料和方法 | 第42-46页 |
| 4．2．1 材料 | 第42-43页 |
| 4．2．2 实验方法 | 第43-46页 |
| 4．2．2．1 测定噬菌体滴度 | 第43页 |
| 4．2．2．2 淘选程序 | 第43-44页 |
| 4．2．2．3 噬菌斑的扩增 | 第44页 |
| 4．2．2．4 测序模板的快速纯化 | 第44页 |
| 4．2．2．5 用 ELISA检测所选多肽对靶分子的结合 | 第44-45页 |
| 4．2．2．6 用斑点杂交(Dot-blot)来检测所选多肽与靶分子的结合 | 第45-46页 |
| 4．3 结果与分析 | 第46-47页 |
| 4．3．1 ACEZA的亲和筛选 | 第46页 |
| 4．3．2 噬菌体克隆的特异性鉴定． | 第46页 |
| 4．3．3 所筛选出的7个多肽与 S蛋白的氨基酸进行 BLAST比对 | 第46-47页 |
| 4．4 讨论 | 第47-50页 |
| 参考文献 | 第50-55页 |
| 致谢 | 第55页 |
