| 中文摘要 | 第1-13页 |
| ABSTRACT | 第13-16页 |
| 英文缩写说明 | 第16-17页 |
| 第一章 前言 | 第17-38页 |
| 1 农杆菌介导真菌的遗传转化研究进展 | 第17-26页 |
| ·根癌农杆菌介导的真菌遗传转化的机理 | 第18-21页 |
| ·根癌农杆菌Ti质粒载体系统的发展 | 第21-22页 |
| ·共整合载体系统 | 第21-22页 |
| ·双源载体系统 | 第22页 |
| ·转基因真菌的遗传表达 | 第22-25页 |
| ·T-DNA在真菌中的存在方式 | 第22-25页 |
| ·复制型载体 | 第22-23页 |
| ·整合型质粒 | 第23-25页 |
| ·影响转基因表达的主要因素 | 第25页 |
| ·启动子对外源基因表达活性的影响 | 第25页 |
| ·外源基因在转基因后代中的遗传行为分析 | 第25页 |
| ·结语 | 第25-26页 |
| 2 透明颤菌血红蛋白基因的应用研究 | 第26-36页 |
| ·透明颤菌血红蛋白的结构及特性 | 第26-28页 |
| ·透明颤菌血红蛋白的作用机制 | 第28-30页 |
| ·Vitreoscilla血红蛋白基因的克隆和表达调控研究 | 第30-33页 |
| ·透明颤菌血红蛋白在发酵等工业上的应用 | 第33-36页 |
| 3 本课题的立题意义和研究内容 | 第36-38页 |
| 第二章 透明颤菌血红蛋白基因表达载体的构建 | 第38-57页 |
| ·实验材料 | 第39-42页 |
| ·菌种和质粒 | 第39页 |
| ·培养基 | 第39页 |
| ·主要溶液和缓冲液 | 第39-41页 |
| ·试剂 | 第41页 |
| ·生化试剂 | 第41页 |
| ·培养基成分 | 第41页 |
| ·主要实验仪器设备 | 第41-42页 |
| ·实验方法 | 第42-46页 |
| ·菌种的培养和保藏 | 第42页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第42页 |
| ·大肠杆菌质粒分离 | 第42-43页 |
| ·大肠杆菌质粒的转化 | 第43页 |
| ·DNA片段的回收 | 第43-44页 |
| ·DNA浓度的测定 | 第44页 |
| ·其他DNA操作 | 第44页 |
| ·DNA序列测定 | 第44页 |
| ·根癌农杆菌电激转化条件 | 第44-45页 |
| ·三亲杂交条件 | 第45页 |
| ·PCR反应 | 第45-46页 |
| ·实验结果 | 第46-55页 |
| ·中间载体质粒pYG306的构建及酶切鉴定 | 第46-48页 |
| ·电激转化法转化根癌农杆菌的研究 | 第48-51页 |
| ·电场强度对根癌农杆菌存活率的影响 | 第48-49页 |
| ·电场强度及电脉冲时间对转化率的影响 | 第49-50页 |
| ·细胞浓度对转化率的影响 | 第50页 |
| ·根癌农杆菌生长时期对转化率的影响 | 第50-51页 |
| ·影响三亲杂交法的各种因素 | 第51页 |
| ·抗性转化子质粒的酶切验证 | 第51-52页 |
| ·PCR扩增根癌农杆菌质粒中的vgb基因 | 第52-53页 |
| ·vgb基因的亚克隆和测序 | 第53-55页 |
| ·讨论 | 第55-56页 |
| ·小结 | 第56-57页 |
| 第三章 根癌农杆菌介导的质粒对顶头孢霉的转化研究 | 第57-83页 |
| ·实验材料 | 第59-61页 |
| ·菌种和质粒 | 第59页 |
| ·培养基 | 第59-60页 |
| ·主要溶液和缓冲液 | 第60-61页 |
| ·实验方法 | 第61-64页 |
| ·菌种的培养和保藏 | 第61页 |
| ·原生质体的制备与再生 | 第61页 |
| ·原生质体的制备、分离与纯化 | 第61页 |
| ·原生质体的的再生 | 第61页 |
| ·顶头孢霉总DNA的提取 | 第61-62页 |
| ·顶头孢霉DNA浓度的测定 | 第62页 |
| ·顶头孢霉PEG-CaCl_2原生质体质粒转化法 | 第62页 |
| ·Southern bloting分析 | 第62页 |
| ·根癌农杆菌Ti质粒介导的顶头孢霉转化 | 第62-63页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第63-64页 |
| ·凝胶组分 | 第63页 |
| ·缓冲液 | 第63页 |
| ·凝胶制备方法及电泳 | 第63-64页 |
| ·VHb表达的CO结合试验 | 第64页 |
| ·实验结果 | 第64-83页 |
| ·博莱霉素对顶头孢霉最低抑菌浓度的测定 | 第64-66页 |
| ·根癌农杆菌Ti质粒介导的顶头孢霉转化方法的建立 | 第66-68页 |
| ·顶头孢霉菌丝的共转化及博莱霉素抗性分析 | 第66-67页 |
| ·顶头孢霉原生质体的共转化及博莱霉素抗性分析 | 第67-68页 |
| ·PEG-CaCl_2原生质体转化法与根癌农杆菌介导转化法的比较 | 第68页 |
| ·顶头孢霉抗性转化子基因组DNA的提取 | 第68-70页 |
| ·顶头孢霉博莱霉素抗性转化子基因组DNA的Southern blot杂交分析 | 第70-71页 |
| ·PCR扩增vgb基因 | 第71-74页 |
| ·PCR引物的设计 | 第71-72页 |
| ·PCR反应体系的建立 | 第72-74页 |
| ·vgb基因的亚克隆和测序 | 第74-76页 |
| ·vgb基因的同源性分析 | 第76-78页 |
| ·VHb蛋白在顶头孢霉中的表达的CO结合试验分析 | 第78-80页 |
| ·讨论 | 第80-81页 |
| ·小结 | 第81-83页 |
| 第四章 VHb在顶头孢霉中的表达对发酵产物的影响 | 第83-96页 |
| ·实验材料 | 第83-84页 |
| ·菌株 | 第83页 |
| ·培养基和溶液 | 第83-84页 |
| ·主要仪器和设备 | 第84页 |
| ·实验方法 | 第84-86页 |
| ·头孢菌素C的发酵 | 第84页 |
| ·发酵液样品的取样及菌丝量的测定 | 第84页 |
| ·HPLC分析 | 第84-86页 |
| ·顶头孢霉转化子稳定性的检测 | 第86页 |
| ·实验结果 | 第86-93页 |
| ·工程菌的直接发酵代谢产物分析 | 第86-89页 |
| ·vgb的表达对头孢菌素C发酵产量的影响 | 第89-90页 |
| ·各转化子发酵生产头孢菌素C能力的研究 | 第90-91页 |
| ·顶头孢霉转化子的稳定性 | 第91-93页 |
| ·不同转化子的主要形态特征与性能的比较 | 第91-92页 |
| ·三种方法所获转化子的产抗水平和稳定性比较 | 第92-93页 |
| ·讨论 | 第93-95页 |
| ·小结 | 第95-96页 |
| 第五章 产黄青霉遗传转化体系的建立及vgb基因的克隆研究 | 第96-115页 |
| 第一节 产黄青霉原生质体的制备和再生研究 | 第96-106页 |
| ·实验材料 | 第96-98页 |
| ·菌种和质粒 | 第96页 |
| ·培养基 | 第96-97页 |
| ·主要溶液和缓冲液 | 第97-98页 |
| ·实验方法 | 第98-99页 |
| ·菌种的培养和保藏 | 第98页 |
| ·原生质体的制备、分离与纯化 | 第98页 |
| ·原生质体的再生 | 第98页 |
| ·渗透压处理及再生率计算 | 第98-99页 |
| ·青霉素V定量分析法 | 第99页 |
| ·实验结果 | 第99-105页 |
| ·菌丝预处理的影响 | 第99-100页 |
| ·硫醇类化合物种类和预处理时间对酶解释放原生质体的影响 | 第99-100页 |
| ·菌龄对酶解效果的影响 | 第100-101页 |
| ·培养基的成分对菌丝释放原生质体的影响 | 第101页 |
| ·缓冲液体系pH值对原生质体形成的作用 | 第101-102页 |
| ·酶解温度及酶解时间对原生质体形成的影响 | 第102页 |
| ·Lysing酶使用浓度对原生质体释放的影响 | 第102-103页 |
| ·原生质体的再生 | 第103-105页 |
| ·原生质体的直径大小与再生的关系 | 第103页 |
| ·原生质体存放方式与再生的关系 | 第103-104页 |
| ·原生质体再生菌株的产抗能力 | 第104-105页 |
| ·小结 | 第105-106页 |
| 第二节 vgb基因在产黄青霉中的转化系统的建立及性能研究 | 第106-115页 |
| ·实验材料 | 第107页 |
| ·菌种和质粒 | 第107页 |
| ·培养基 | 第107页 |
| ·实验方法 | 第107-109页 |
| ·产黄青霉总DNA的提取 | 第107页 |
| ·Southern bloting分析 | 第107-109页 |
| ·PEG-CaCl_2原生质体质粒转化法 | 第109页 |
| ·根癌农杆菌Ti质粒介导的产黄青霉转化 | 第109页 |
| ·实验结果与讨论 | 第109-114页 |
| ·博莱霉素对产黄青霉的最低抑菌浓度测定 | 第109-110页 |
| ·质粒pYG715vgb转化产黄青霉原生质体 | 第110页 |
| ·根癌农杆菌介导的vgb转化产黄青霉的研究 | 第110-111页 |
| ·两种转化方法的转化效率比较 | 第111页 |
| ·外源基因在转化菌株传代中的稳定性 | 第111-112页 |
| ·southern blotting分析 | 第112-113页 |
| ·VHb蛋白在产黄青霉中的表达的CO结合试验分析 | 第113-114页 |
| ·小结 | 第114-115页 |
| 结论 | 第115-116页 |
| 参考文献 | 第116-124页 |
| 致谢 | 第124-125页 |
| 作者简历及论文发表情况 | 第125-126页 |
| 附录 | 第126-131页 |
