| 缩略词 | 第1-11页 |
| 第一部分 文献综述-酵母人工染色体及其转基因动物 | 第11-31页 |
| ·前言 | 第11-12页 |
| ·酵母人工染色体(YAC) | 第12-15页 |
| ·YAC的背景知识 | 第12-13页 |
| ·YAC载体和菌株的发展 | 第13-15页 |
| ·YAC克隆载体系列 | 第13-15页 |
| ·酵母宿主菌 | 第15页 |
| ·YAC克隆的不稳定性和嵌合性 | 第15-17页 |
| ·YAC克隆的不稳定性 | 第15-16页 |
| ·嵌合YAC克隆 | 第16-17页 |
| ·YAC插入子的遗传学操作 | 第17-18页 |
| ·YAC插入子的遗传操作应用 | 第17页 |
| ·选择性标记 | 第17-18页 |
| ·用于转基因研究的YAC载体的优化 | 第18页 |
| ·YAC转基因动物的制备 | 第18-20页 |
| ·酵母和ES细胞融合 | 第19-20页 |
| ·ES细胞的脂质体转染 | 第20页 |
| ·原核显微注射 | 第20页 |
| ·YAC DNA的纯化 | 第20页 |
| ·YAC转基因小鼠的鉴定与结构性分析 | 第20-22页 |
| ·详细结构分析的方法 | 第21-22页 |
| ·整合位点和拷贝数分析 | 第22页 |
| ·YAC转基因鼠的表达研究 | 第22-25页 |
| ·通过对插入YAC内的序列进行突变来研究基因表达的顺式调控元件 | 第22-23页 |
| ·生物反应器 | 第23-24页 |
| ·人类疾病的动物模型 | 第24-25页 |
| ·大动物的YAC转基因 | 第25页 |
| ·结束语 | 第25-26页 |
| 参考文献 | 第26-31页 |
| 第二部分 不同条件下HLA-YAC高效定点打靶修饰方法的建立 | 第31-45页 |
| 1 材料和方法 | 第31-39页 |
| ·材料 | 第31-33页 |
| ·菌种 | 第31-32页 |
| ·质粒载体及引物 | 第32页 |
| ·主要试剂材料 | 第32页 |
| ·主要仪器设备 | 第32页 |
| ·主要试剂的配制 | 第32-33页 |
| ·方法 | 第33-39页 |
| ·酵母菌株基因型及培养基 | 第33页 |
| ·YAC转移 | 第33页 |
| ·转移YAC的PFGE分析 | 第33-34页 |
| ·实验载体构建中通用步骤 | 第34-37页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备(电转化法) | 第34页 |
| ·质粒转化 | 第34页 |
| ·质粒DNA的小量制备(碱裂解法) | 第34-35页 |
| ·质粒DNA的大量提取及纯化 | 第35页 |
| ·限制性内切酶酶切反应 | 第35-36页 |
| ·DNA片段3’端的补平 | 第36页 |
| ·电泳DNA片段的分离与回收 | 第36页 |
| ·线性DNA的末端脱磷 | 第36页 |
| ·连接反应 | 第36-37页 |
| ·PCR反应体系 | 第37页 |
| ·定点打靶修饰载体构建 | 第37-38页 |
| ·电穿孔法转化酵母细胞 | 第38页 |
| ·酵母感受态细胞的制备 | 第38页 |
| ·电穿孔法转化 | 第38页 |
| ·醋酸锂法转化酵母细胞 | 第38-39页 |
| ·菌落PCR鉴定 | 第39页 |
| ·PCR引物设计 | 第39页 |
| ·酵母菌落裂解液的制备及PCR反应条件 | 第39页 |
| 2 结果 | 第39-43页 |
| ·HLA-YAC由AB1380转移至YPH925 | 第39-40页 |
| ·打靶载体的酶切鉴定 | 第40-41页 |
| ·以选择标记的筛选作用对定点整合的初步筛选 | 第41页 |
| ·用HIS3为选择标记对YPH925内HLA-YAC的打靶筛选 | 第41页 |
| ·用G418R为选择标记对AB1380和YPH925的打靶筛选 | 第41页 |
| ·菌落PCR鉴定 | 第41-42页 |
| ·克隆pG7-8测序结果 | 第42-43页 |
| 3 讨论 | 第43-44页 |
| 参考文献 | 第44-45页 |
| 第三部分 乳腺特异性表达rHSA嵌合体YAC载体的构建 | 第45-59页 |
| 1 材料和方法 | 第46-53页 |
| ·材料 | 第46-48页 |
| ·菌种 | 第46页 |
| ·质粒载体及引物 | 第46页 |
| ·主要试剂材料 | 第46页 |
| ·主要仪器设备 | 第46-47页 |
| ·主要试剂的配制 | 第47-48页 |
| ·方法 | 第48-53页 |
| ·打靶载体的构建 | 第48-50页 |
| ·酵母内对HLA-YAC定点打靶 | 第50-51页 |
| ·质粒转化 | 第50页 |
| ·抗性菌落的交叉筛选 | 第50-51页 |
| ·菌落PCR鉴定 | 第51页 |
| ·Southern杂交鉴定 | 第51-53页 |
| ·酵母基因组抽提 | 第51-52页 |
| ·基因组限制性内切酶消化、电泳和转膜 | 第52-53页 |
| 2 结果 | 第53-56页 |
| ·打靶载体的酶切鉴定 | 第53-54页 |
| ·酵母内的HLA-YAC同源重组菌落PCR鉴定结果 | 第54-55页 |
| ·酵母内的HLA-YAC同源重组Southern鉴定结果 | 第55-56页 |
| 3 讨论 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-59页 |
| 第四部分 用于核移植克隆表达rHSA嵌合HLA-YAC山羊胎儿成纤维细胞株的制备 | 第59-79页 |
| 1 材料与方法 | 第60-71页 |
| ·材料 | 第60-61页 |
| ·细胞 | 第60页 |
| ·主要试剂材料 | 第60页 |
| ·主要仪器设备 | 第60页 |
| ·主要试剂的配制 | 第60-61页 |
| ·方法 | 第61-71页 |
| ·酵母原生质体与羊胎儿成纤维细胞融合 | 第61-64页 |
| ·细胞基因组DNA的抽提 | 第64页 |
| ·抗性克隆的PCR分析 | 第64-67页 |
| ·抗性克隆的Southern分析 | 第67-71页 |
| 2 结果 | 第71-74页 |
| ·酵母原生质体与羊的胎儿成纤维细胞融合 | 第71-72页 |
| ·抗性克隆的PCR鉴定 | 第72页 |
| ·抗性克隆的Southern鉴定 | 第72-74页 |
| 3 讨论 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-79页 |
| 结论 | 第79-80页 |
| 发表文章目录 | 第80-81页 |
| 致谢 | 第81页 |
