| 中文摘要 | 第1-3页 |
| Abstract | 第3-5页 |
| 中文文摘 | 第5-8页 |
| 目录 | 第8-12页 |
| 绪论 | 第12-26页 |
| 第一节 人类杯状病毒研究现状及意义 | 第12-16页 |
| 1.人类杯状病毒的分类和命名 | 第12页 |
| 2.人类杯状病毒的分子生物学特征 | 第12-13页 |
| 3.人类杯状病毒分子流行病学研究概况 | 第13-14页 |
| 4.人类杯状病毒的疫苗研究现状 | 第14-15页 |
| 5.人类杯状病毒的检测方法 | 第15-16页 |
| ·经典检测技术 | 第15页 |
| ·酶联免疫吸附检测技术 | 第15-16页 |
| ·基因检测技术 | 第16页 |
| 第二节 环介导等温扩增技术(LAMP) | 第16-23页 |
| 1.环介导等温扩增技术简介 | 第16-17页 |
| 2.LAMP反应引物设计 | 第17-18页 |
| 3.LAMP反应原理 | 第18-21页 |
| 4.LAMP反应特点 | 第21-22页 |
| 5.LAMP技术的应用 | 第22-23页 |
| ·对DNA病毒的检测 | 第22页 |
| ·对RNA病毒的检测 | 第22-23页 |
| ·对细菌的检测 | 第23页 |
| ·对真菌的检测 | 第23页 |
| 第三节 课题研究的意义及前景 | 第23-26页 |
| 第一章 札如病毒的pET-28a(+)-SVA的构建 | 第26-44页 |
| 第一节 前言 | 第26页 |
| 第二节 材料与方法 | 第26-37页 |
| 1.材料 | 第26-28页 |
| ·载体和菌株 | 第26页 |
| ·人工合成SVA基因序列的引物 | 第26-27页 |
| ·培养基 | 第27页 |
| ·主要仪器与试剂 | 第27-28页 |
| 2.方法 | 第28-37页 |
| ·SV氨基酸序列的选取及碱基序列的翻译 | 第28-30页 |
| ·人工合成SVA基因序列的模板反应体系 | 第30-31页 |
| ·人工合成SVA基因序列的模板反应条件 | 第31-32页 |
| ·SVA的PCR产物加A尾: | 第32页 |
| ·SVA基因片段的TA克隆 | 第32-33页 |
| ·质粒抽提 | 第33-34页 |
| ·分别酶切pMD19-T-SVA和pET28a(+) | 第34页 |
| ·DNA片段的凝胶回收 | 第34-35页 |
| ·SVA目的片段与pET28a(+)载体的连接及pET28a(+)-SVA的转化 | 第35页 |
| ·重组质粒pET28a(+)-SVA的筛选 | 第35-36页 |
| ·植菌和提质粒酶切鉴定 | 第36页 |
| ·重组质粒pET28a(+)-SVA的转化及鉴定 | 第36-37页 |
| 第三节 结果与讨论 | 第37-42页 |
| 1.pET28a(+)-SVA载体构建原理(见图1-1): | 第37-38页 |
| 2.人工合成SVA基因序列 | 第38页 |
| 3.SVA基因序列的PCR扩增 | 第38-39页 |
| 4.SVA基因片段PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳 | 第39页 |
| 5.SVA基因片段的TA克隆和克隆质粒测序 | 第39-40页 |
| 6.酶切pET28a(+)和克隆质粒pMD19-T-SVA | 第40页 |
| 7.表达质粒pET28a(+)和SVA基因片段的连接和转化 | 第40页 |
| 8.重组表达质粒的菌落PCR及酶切鉴定 | 第40-41页 |
| ·重组表达质粒的菌落PCR鉴定 | 第40-41页 |
| ·重组表达质粒的酶切鉴定 | 第41页 |
| 9.重组表达质粒测序及分析 | 第41-42页 |
| 第四节 结论 | 第42-44页 |
| 第二章 SVA基因蛋白的表达和鉴定 | 第44-54页 |
| 第一节 前言 | 第44页 |
| 第二节 材料与方法 | 第44-49页 |
| 1 材料 | 第44-45页 |
| ·菌种 | 第44页 |
| ·培养基 | 第44页 |
| ·主要仪器与试剂 | 第44-45页 |
| ·配制液 | 第45页 |
| 2 方法 | 第45-49页 |
| ·表达菌株的筛选和目的蛋白的诱导表达 | 第45-46页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第46-48页 |
| ·考马斯亮蓝染色 | 第48页 |
| ·Western blotting | 第48页 |
| ·抗体反应及显色反应 | 第48-49页 |
| 第三节 结果与讨论 | 第49-51页 |
| 1.SVA基因片段的诱导表达 | 第49页 |
| ·筛选表达菌株 | 第49页 |
| ·诱导表达 | 第49页 |
| 2.SVA蛋白的SDS-PAGE电泳检测 | 第49-50页 |
| 3.Western blotting | 第50-51页 |
| 第四节 结论 | 第51-54页 |
| 第三章 环介导等温扩增(LAMP)检测人类杯状病毒 | 第54-78页 |
| 第一节 前言 | 第54页 |
| 第二节 材料与方法 | 第54-66页 |
| 1.材料 | 第54-57页 |
| ·试剂 | 第54页 |
| ·样本 | 第54-55页 |
| ·引物 | 第55-57页 |
| 2.方法 | 第57-66页 |
| ·病毒RNA抽提 | 第57-58页 |
| ·病毒RNA反转录反应 | 第58页 |
| ·引物设计 | 第58-59页 |
| ·LAMP扩增反应条件及优化 | 第59页 |
| ·LAMP反应的特异性的判断 | 第59-60页 |
| ·LAMP方法检测的灵敏度 | 第60-61页 |
| ·Norwalk virus菌株的人工基因序列的合成及PCR | 第61-63页 |
| ·人工基因片段凝胶回收 | 第63页 |
| ·人工基因片段的PCR产物加A尾 | 第63页 |
| ·NVA基因片段的TA克隆 | 第63-64页 |
| ·质粒DNA抽提 | 第64页 |
| ·分别酶切pMD19-T-NVA和pET28a(+) | 第64页 |
| ·NVA基因片段与pET28a(+)载体的连接和转化 | 第64-65页 |
| ·重组质粒pET28a(+)-NVA的筛选 | 第65页 |
| ·重组质粒pET28a(+)-NVA酶切鉴定 | 第65-66页 |
| ·以重组质粒pET28a(+)-NVA体外转录成mRNA | 第66页 |
| ·LAMP扩增产物的显色反应 | 第66页 |
| 第三节 结果与讨论 | 第66-76页 |
| 1.LAMP反应引物示意图及其基因扩增结果 | 第66-68页 |
| 2.LAMP反应条件优化 | 第68-70页 |
| ·Mg2~+浓度 | 第68-69页 |
| ·反应温度 | 第69-70页 |
| ·反应时间 | 第70页 |
| 3.LAMP反应特异性 | 第70-71页 |
| ·LAMP扩增产物特异性 | 第70-71页 |
| ·LAMP引物特异性 | 第71页 |
| 4.LAMP法检测的灵敏度 | 第71-72页 |
| 5.显色反应 | 第72-73页 |
| 6.LAMP法和RT-PCR法检测诺如病毒的结果比较 | 第73-75页 |
| 7.LAMP法检测札如病毒结果 | 第75-76页 |
| 第四节 结论 | 第76-78页 |
| 第四章 结论 | 第78-80页 |
| 附录1 | 第80-82页 |
| 附录2 | 第82-84页 |
| 参考文献 | 第84-90页 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 | 第90-92页 |
| 致谢 | 第92-94页 |
| 个人简历 | 第94-95页 |
