| 摘要 | 第4-5页 |
| abstract | 第5-6页 |
| 引言 | 第13-19页 |
| 0.1 肾结石疾病概述 | 第13页 |
| 0.2 蛋白与肾结石形成 | 第13-15页 |
| 0.3 基质γ-羧基谷氨酸蛋白(MGP)及其与肾结石的关系 | 第15页 |
| 0.4 MGP与其它蛋白的相互作用 | 第15-16页 |
| 0.5 T7噬菌体展示系统 | 第16-17页 |
| 0.6 分子模拟技术用于研究蛋白相互作用 | 第17-18页 |
| 0.7 研究的目的与意义 | 第18-19页 |
| 第1章 重组质粒pT7CFE1-NHis-GST-CHA-MGP的构建及MGP蛋白的体外表达 | 第19-37页 |
| 1.1 引言 | 第19-21页 |
| 1.1.1 重组质粒pT7CFE1-NHis-GST-CHA-MGP的构建 | 第19-20页 |
| 1.1.2 1-Step Human High-Yield Mini IVT Kit体外表达MGP蛋白 | 第20-21页 |
| 1.2 实验材料 | 第21-23页 |
| 1.2.1 生化试剂耗材 | 第21-22页 |
| 1.2.2 主要仪器设备 | 第22页 |
| 1.2.3 试剂的配制 | 第22-23页 |
| 1.3 实验方法 | 第23-32页 |
| 1.3.1 pMD19-MGP和pT7CFE1-NHis-GST-CHA质粒的转化、扩增 | 第23-26页 |
| 1.3.1.1 质粒转化 | 第23-24页 |
| 1.3.1.2 质粒小量提取 | 第24页 |
| 1.3.1.3 质粒酶切验证 | 第24-25页 |
| 1.3.1.4 质粒中提扩增 | 第25-26页 |
| 1.3.2 片段回收 | 第26-27页 |
| 1.3.3 酶连重组 | 第27页 |
| 1.3.4 重组质粒的酶切验证和序列测定 | 第27-28页 |
| 1.3.5 1-Step Human High-Yield Mini IVT Kit表达MGP | 第28-30页 |
| 1.3.5.1 实验前质粒样本纯化 | 第28页 |
| 1.3.5.2 高效表达MGP蛋白 | 第28-29页 |
| 1.3.5.3 BCA法测定表达MGP蛋白的浓度 | 第29-30页 |
| 1.3.6 Pierce~(TM) HRV 3C Protease 1000 Unit Kit纯化MGP蛋白 | 第30页 |
| 1.3.7 纯化后MGP蛋白Western Blot检测 | 第30-32页 |
| 1.4 实验结果与讨论 | 第32-35页 |
| 1.4.1 重组质粒pT7CFE1-NHis-GST-CHA-MGP的构建 | 第32-34页 |
| 1.4.1.1 质粒pMD19-MGP的双酶切验证结果 | 第32-33页 |
| 1.4.1.2 pMD19-MGP质粒和pT7CFE1-NHis-GST-CHA质粒中提后的双酶切验证结果 | 第33页 |
| 1.4.1.3 重组质粒pT7CFE1-NHis-GST-CHA-MGP的双酶切验证结果 | 第33-34页 |
| 1.4.2 BCA法测定MGP蛋白浓度 | 第34-35页 |
| 1.4.3 Western Blot检测纯化后MGP蛋白 | 第35页 |
| 1.5 结论 | 第35-37页 |
| 第2章 T7噬菌体展示系统筛选MGP蛋白相互作用蛋白 | 第37-65页 |
| 2.1 引言 | 第37-38页 |
| 2.2 实验材料 | 第38-39页 |
| 2.2.1 生化试剂及耗材 | 第38-39页 |
| 2.2.2 主要仪器设备 | 第39页 |
| 2.3 实验方法 | 第39-46页 |
| 2.3.1 大肠杆菌BLT5403的扩增和保存 | 第39-40页 |
| 2.3.1.1 大肠杆菌BLT5403的复苏 | 第39-40页 |
| 2.3.1.2 大肠杆菌BLT5403生长曲线测定 | 第40页 |
| 2.3.1.3 大肠杆菌BLT5403的保存 | 第40页 |
| 2.3.2 T7噬菌体的扩增和保存 | 第40-41页 |
| 2.3.3 噬菌体的滴度测定 | 第41-42页 |
| 2.3.3.1 T7原始噬菌体滴度测定 | 第41-42页 |
| 2.3.3.2 扩增后的T7噬菌体滴度测定 | 第42页 |
| 2.3.4 噬菌体展示技术可行性实验 | 第42页 |
| 2.3.5 阳性对照实验 | 第42-43页 |
| 2.3.6 MGP蛋白的包被和生物淘洗 | 第43-44页 |
| 2.3.6.1 MGP蛋白的包被 | 第43-44页 |
| 2.3.6.2 生物淘洗 | 第44页 |
| 2.3.7 噬菌斑DNA提取与序列测定 | 第44-46页 |
| 2.3.7.1 噬菌斑DNA的提取 | 第44-45页 |
| 2.3.7.2 噬菌斑DNAPCR扩增与序列测定 | 第45-46页 |
| 2.3.7.3 噬菌斑DNAPCR扩增后的胶回收 | 第46页 |
| 2.3.8 PhageELISA法进一步筛选与验证MGP相互作用蛋白 | 第46页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第46-63页 |
| 2.4.1 人cDNA文库T7噬菌体的初始滴度测定结果 | 第46-47页 |
| 2.4.2 人cDNA文库T7噬菌体的扩增后的滴度测定结果 | 第47页 |
| 2.4.3 噬菌体展示技术可行性实验结果 | 第47-48页 |
| 2.4.4 噬菌体展示阳性对照实验结果 | 第48-49页 |
| 2.4.5 生物淘洗过程中的噬菌体滴度测定结果 | 第49-50页 |
| 2.4.6 噬菌斑DNAPCR扩增的结果 | 第50-52页 |
| 2.4.7 噬菌斑DNA序列测定结果 | 第52-61页 |
| 2.4.8 Phage ELISA法进一步筛选与验证MGP相互作用蛋白 | 第61-63页 |
| 2.5 结论 | 第63-65页 |
| 第3章 分子模拟方法对MGP及其候选互作蛋白SLC27A6的初步研究 | 第65-75页 |
| 3.1 引言 | 第65-67页 |
| 3.1.1 MODELLER | 第65页 |
| 3.1.2 Z-DOCK | 第65页 |
| 3.1.3 MGP蛋白结构 | 第65-66页 |
| 3.1.4 SLC27A6蛋白 | 第66-67页 |
| 3.2 模拟方法 | 第67页 |
| 3.2.1 蛋白质同源建模 | 第67页 |
| 3.2.2 分子对接 | 第67页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第67-73页 |
| 3.3.1 MGP和SLC27A6蛋白结构的同源建模 | 第67-70页 |
| 3.3.2 MGP与SLC27A6蛋白对接结果分析 | 第70-73页 |
| 3.4 结论 | 第73-75页 |
| 第4章 结果与展望 | 第75-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-83页 |
| 攻读学位期间发表学术论文及参加科研情况 | 第83-84页 |
