| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 缩略语表 | 第14-15页 |
| 1 文献综述 | 第15-35页 |
| 1.1 核盘菌的病理循环及菌核病对油菜的危害 | 第15-17页 |
| 1.1.1 核盘菌的病理循环 | 第15-17页 |
| 1.1.2 菌核病对油菜的危害 | 第17页 |
| 1.2 油菜菌核病抗性资源的获得途径 | 第17-20页 |
| 1.2.1 传统育种和分子育种的应用 | 第17-19页 |
| 1.2.2 基因工程在育种上的应用 | 第19-20页 |
| 1.3 植物和病原菌互作的防御系统 | 第20-25页 |
| 1.3.1 植物的先天免疫系统 | 第20-21页 |
| 1.3.2 植物与病原菌互作的防卫应答机制 | 第21-25页 |
| 1.3.2.1 信号转导和植物激素 | 第21-23页 |
| 1.3.2.2 WRKY转录因子的调控 | 第23-24页 |
| 1.3.2.3 代谢物质的积累 | 第24-25页 |
| 1.4 转录组测序技术在研究植物与病原菌互作上的应用 | 第25-26页 |
| 1.5 病原菌PGs基因的表达及其致病性 | 第26-27页 |
| 1.6 植物PGIPs基因的研究进展 | 第27-35页 |
| 1.6.1 PGIPs基因的进化历程 | 第27-28页 |
| 1.6.2 PGIPs基因的表达模式 | 第28-29页 |
| 1.6.3 PGIPs的蛋白结构 | 第29页 |
| 1.6.4 PGIPs基因在植物PTI免疫反应中的作用 | 第29-30页 |
| 1.6.5 PGIPs抑制PGs的作用机理 | 第30-33页 |
| 1.6.5.1 PGIPs和PGs互作的分子基础 | 第30-31页 |
| 1.6.5.2 PGIP和PG互作的蛋白结构研究 | 第31-32页 |
| 1.6.5.3 PGs-PGIPs的体外互作 | 第32-33页 |
| 1.6.6 PGIPs在基因工程中的应用 | 第33-35页 |
| 2 本课题的研究意义和目的 | 第35-36页 |
| 3 材料和方法 | 第36-53页 |
| 3.1 实验材料与菌株 | 第36-37页 |
| 3.2 田间实验设计和管理 | 第37页 |
| 3.3 技术路线 | 第37-38页 |
| 3.4 转基因材料DNA提取与鉴定 | 第38页 |
| 3.5 Southernblot检测 | 第38-39页 |
| 3.6 转基因植株的抗病性鉴定 | 第39-42页 |
| 3.6.1 PDA培养基的制备 | 第39页 |
| 3.6.2 核盘菌的培养与活化 | 第39-40页 |
| 3.6.3 离体叶片接菌 | 第40页 |
| 3.6.4 离体茎秆接菌 | 第40页 |
| 3.6.5 温室和田间喷湿菌丝鉴定 | 第40-42页 |
| 3.6.5.1 菌丝悬浮液的制备 | 第40-41页 |
| 3.6.5.2 温室喷湿菌丝存活率实验 | 第41页 |
| 3.6.5.3 田间喷湿菌丝与发病分级调查 | 第41-42页 |
| 3.6.6 田间茎秆接菌鉴定 | 第42页 |
| 3.7 各株系种子千粒重和品质性状的考察 | 第42页 |
| 3.8 菌斑组织活力和H2O2的鉴定 | 第42-43页 |
| 3.8.1 Trypanblue染色 | 第42-43页 |
| 3.8.2 DABStaining染色 | 第43页 |
| 3.9 叶片提取物体外抗真菌实验 | 第43页 |
| 3.10 油菜茎秆中糖份和木质素含量的鉴定 | 第43-44页 |
| 3.11 qPCR定量检测抗病相关基因的表达 | 第44-45页 |
| 3.11.1 材料的处理与取样 | 第44页 |
| 3.11.2 RNA提取及cDNA合成 | 第44页 |
| 3.11.3 qPCR的定量检测 | 第44-45页 |
| 3.12 OsPGIPs和PGs蛋白的表达和互作研究 | 第45-49页 |
| 3.12.1 OsPGIPs和PGs之间亲和性的预测 | 第45页 |
| 3.12.2 核盘菌RNA的提取 | 第45-46页 |
| 3.12.3 毕赤酵母表达系统表达目的蛋白 | 第46-48页 |
| 3.12.3.1 毕赤酵母表达载体的构建 | 第46-48页 |
| 3.13.3.2 目的蛋白的表达 | 第48页 |
| 3.12.4 SplitLuciferase互补实验 | 第48-49页 |
| 3.13 RNA-seq测序与分析 | 第49-51页 |
| 3.13.1 RNA-seq测序 | 第49-50页 |
| 3.13.2 差异表达基因的筛选 | 第50-51页 |
| 3.13.2.1 GeneOntology(GO)功能显著性富集分析 | 第50-51页 |
| 3.13.2.2 KEGG通路分析 | 第51页 |
| 3.14 OsPGIP2蛋白结构图的绘制 | 第51页 |
| 3.15 PGIPs基因的进化分析 | 第51页 |
| 3.16 植物与核盘菌互作的模式图绘制 | 第51-52页 |
| 3.17 统计数据的分析 | 第52-53页 |
| 4 结果与分析 | 第53-98页 |
| 4.1 抗性稳定遗传的OsPGIP2转基因家系的筛选 | 第53-56页 |
| 4.1.1 OsPGIP2株系的PCR鉴定 | 第53-54页 |
| 4.1.2 转基因家系OsPGIP2基因的相对表达量 | 第54-55页 |
| 4.1.3 Southernblot检测转基因家系OsPGIP2基因拷贝数 | 第55-56页 |
| 4.2 T_2和T_3代转基因家系的抗病性鉴定 | 第56-58页 |
| 4.3 T4代OsPGIP2转基因家系的抗病性鉴定 | 第58-67页 |
| 4.3.1 转基因家系的苗期离体叶片抗病性鉴定 | 第58-61页 |
| 4.3.2 转基因家系的苗期活体喷菌丝鉴定 | 第61-63页 |
| 4.3.3 转基因家系的成株期茎秆抗病性鉴定 | 第63-66页 |
| 4.3.4 转基因家系的田间喷菌丝鉴定 | 第66-67页 |
| 4.4 转基因家系的种子千粒重和品质性状分析 | 第67-70页 |
| 4.4.1 菌丝块接菌小区的千粒重和品质性状分析 | 第67-68页 |
| 4.4.2 喷菌丝小区的千粒重和品质性状分析 | 第68-70页 |
| 4.5 转录组数据分析OsPGIP2介导的抗病路径 | 第70-82页 |
| 4.5.1 鉴定转基因和非转基因材料之间的差异表达基因 | 第70-72页 |
| 4.5.2 差异表达基因的功能聚类 | 第72-74页 |
| 4.5.3 转录因子的表达 | 第74-76页 |
| 4.5.4 硫苷合成相关基因的表达 | 第76-77页 |
| 4.5.5 菌核病抗性相关的差异表达基因 | 第77-81页 |
| 4.5.6 qPCR验证RNA-seq数据 | 第81-82页 |
| 4.6 接菌叶片H2O2和病斑位置菌丝的检测 | 第82-84页 |
| 4.7 转基因油菜叶片提取物抑制核盘菌的生长 | 第84-85页 |
| 4.8 茎秆细胞壁单糖含量和木质素的变化 | 第85-89页 |
| 4.9 转基因植物中检测核盘菌的SsPGs基因的表达 | 第89-91页 |
| 4.10 蛋白水平上分析OsPGIP2的功能 | 第91-98页 |
| 4.10.1 OsPGIP2蛋白结构分析 | 第91-93页 |
| 4.10.1.1 高等植物PGIPs的进化分析 | 第91-93页 |
| 4.10.1.2 OsPGIP2蛋白的3D结构 | 第93页 |
| 4.10.2 致病活性SsPG6蛋白的提取 | 第93-95页 |
| 4.10.3 SplitLuciferase(LUC)验证OsPGIP2与SsPGs之间的互作 | 第95-98页 |
| 5 讨论 | 第98-107页 |
| 5.1 OsPGIP2转基因油菜增加菌核病抗性资源的储备 | 第98-99页 |
| 5.2 SsPGs-PGIPs互作具有序列特异性 | 第99-101页 |
| 5.2.1 体外和体内SsPGs-PGIP的互作验证 | 第99-100页 |
| 5.2.2 SsPGs-PGIPs互作的特异性 | 第100-101页 |
| 5.3 接菌方法对菌核病鉴定的影响 | 第101-102页 |
| 5.4 菌核病对种子千粒重和品质的影响 | 第102-103页 |
| 5.5 细胞壁糖类与菌核病抗性的关系 | 第103-105页 |
| 5.6 H_2O_2与菌核病的关系 | 第105页 |
| 5.7 OsPGIP2参与调控植物防卫反应途径 | 第105-107页 |
| 参考文献 | 第107-125页 |
| 附录Ⅰ：本实验所用引物 | 第125-128页 |
| 附录Ⅱ：WRKY转录因子家族RNA-seq结果 | 第128-129页 |
| 附录Ⅲ：7-5Dvs.7-5WT防卫反应相关基因RNA-seq结果 | 第129-133页 |
| 附录Ⅳ：T45B | 第133-136页 |
| 附录Ⅴ：qPCR检测7-5背景不同接菌点差异表达基因 | 第136-137页 |
| 附录Ⅵ：qPCR检测T45背景不同接菌点差异表达基因 | 第137-138页 |
| 附录Ⅶ：硫苷合成相关基因RNA-seq结果 | 第138-140页 |
| 附录Ⅷ：作者简介和在读期间发表论文 | 第140-142页 |
| 致谢 | 第142-144页 |
