| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 缩略词 | 第8-13页 |
| 第一章 绪论 | 第13-22页 |
| 1.副溶血弧菌概论 | 第13页 |
| 2.副溶血弧菌的毒力因子 | 第13-17页 |
| 2.1 溶血毒素(TDH/TRH/TLH) | 第13页 |
| 2.2 粘附素(MAM7) | 第13页 |
| 2.3 Ⅲ型分泌系统(T3SSs) | 第13-16页 |
| 2.3.1 T3SS1研究现状 | 第14-15页 |
| 2.3.2 副溶血弧菌T3SS2研究现状 | 第15-16页 |
| 2.4 VI型分泌系统(T6SSs) | 第16-17页 |
| 3.环二鸟苷酸的研究现状 | 第17-20页 |
| 3.1 环二鸟苷酸的基本信息 | 第17页 |
| 3.2 环二鸟苷酸的研究现状 | 第17-20页 |
| 3.2.1 环二鸟苷酸的主要功能 | 第18页 |
| 3.2.2 环二鸟苷酸/STING天然免疫信号通路 | 第18-20页 |
| 4.VPA1324概况 | 第20页 |
| 5.研究目的和意义 | 第20-22页 |
| 第二章 实验材料、仪器和试剂 | 第22-27页 |
| 1.实验材料 | 第22页 |
| 1.1 实验菌株 | 第22页 |
| 1.2 实验质粒 | 第22页 |
| 1.3 细胞 | 第22页 |
| 2.实验仪器 | 第22-23页 |
| 3.实验试剂 | 第23-24页 |
| 4.主要试剂配制 | 第24-27页 |
| 第三章 实验方法 | 第27-46页 |
| 1.VPA1324的生物信息学分析 | 第27页 |
| 2.vpa1324基因有关重组载体构建和敲除菌的构建 | 第27-36页 |
| 2.1 构建重组质粒 | 第27-35页 |
| 2.1.1 pC1-vpa1324重组载体的构建 | 第27-30页 |
| 2.1.2 pEGFP-C1-vpa1324重组载体的构建 | 第30-31页 |
| 2.1.3 pET28a(+)-vpa1324重组载体的构建 | 第31页 |
| 2.1.4 pRE112-ΔvcrD1重组载体的构建 | 第31-33页 |
| 2.1.5 pRE112-ΔvcrD2重组载体的构建 | 第33-34页 |
| 2.1.6 pRE112-Δvpa1324重组载体的构建 | 第34-35页 |
| 2.2 构建敲除菌vcrD1基因片段的POR2菌 | 第35-36页 |
| 2.2.1 第一轮重组 | 第35页 |
| 2.2.2 第二轮重组 | 第35-36页 |
| 3.VPA1324的表达、纯化和抗血清的制备 | 第36-37页 |
| 3.1 VPA1324的表达 | 第36页 |
| 3.2 VPA1324的纯化 | 第36-37页 |
| 3.3 VPA1324抗血清的制备 | 第37页 |
| 4.LC-MS/MS体外检测VPA1324具有EAL二鸟苷酸磷酸二酯酶活性 | 第37-38页 |
| 4.1 样品预处理 | 第37页 |
| 4.2 LC-MS/MS进样前用Ziptip对样品进行脱盐处理 | 第37-38页 |
| 4.3 质谱柱预处理和LC-MS/MS检测 | 第38页 |
| 5.HeLa细胞和Caco-2细胞的复苏、传代、计数和铺板 | 第38-39页 |
| 5.1 HeLa细胞和Caco-2细胞的复苏 | 第38页 |
| 5.2 HeLa细胞和Caco-2细胞的传代 | 第38-39页 |
| 5.3 HeLa细胞和Caco-2细胞的计数 | 第39页 |
| 5.4 HeLa细胞和Caco-2细胞的铺板 | 第39页 |
| 6.VPA1324依赖T3SS2分泌至真核细胞 | 第39-43页 |
| 6.1 验证VPA1324是分泌蛋白 | 第39-40页 |
| 6.1.1 pBBR1MCS2系列质粒转化至POR2感受态中 | 第39页 |
| 6.1.2 VPA1324分泌蛋白的提取 | 第39-40页 |
| 6.1.3 Western blot检验VPA1324的分泌情况 | 第40页 |
| 6.2 VPA1324依赖T3SS2注入真核细胞 | 第40-43页 |
| 6.2.1 感染菌感染Caco-2细胞 | 第40-41页 |
| 6.2.2 验证VPA1324对Caco-2细胞的cAMP水平的影响 | 第41-43页 |
| 7.Real-TimeqPCR检测VPA1324对宿主细胞的调控作用 | 第43-46页 |
| 7.1 提取质粒pC1-vpa1324、pEGFP-C1-vpa1324和pEGFP-C | 第43页 |
| 7.2 重组质粒pC1-vpa1324、pEGFP-C1-vpa1324和pEGFP-C1转染HeLa和Caco-细胞 | 第43页 |
| 7.3 cdG转染HeLa和Caco-2细胞 | 第43-44页 |
| 7.4 转染细胞样品总RNA提取 | 第44页 |
| 7.5 逆转录实验 | 第44页 |
| 7.6 Real-TimeqPCR检测转染细胞中IRF3水平变化 | 第44-46页 |
| 7.6.1 Real-TimeqPCR引物设计和合成 | 第44页 |
| 7.6.2 Real-TimeqPCR扩增体系和反应条件 | 第44-45页 |
| 7.6.3 Real-TimeqPCR基因表达差异统计分析 | 第45-46页 |
| 第四章 实验结果 | 第46-63页 |
| 1.VPA1324生物信息学分析 | 第46-47页 |
| 2.vpa1324基因有关重组载体构建和敲除菌的构建 | 第47-56页 |
| 2.1 构建重组质粒 | 第47-53页 |
| 2.1.1 pC1-vpa1324重组载体的构建 | 第48-49页 |
| 2.1.2 pEGFP-C1-vpa1324重组载体的构建 | 第49页 |
| 2.1.3 pET28a(+)-vpa1324重组载体的构建 | 第49-50页 |
| 2.1.4 pRE112-ΔvcrD1重组载体的构建 | 第50-51页 |
| 2.1.5 pRE112-ΔvcrD2重组载体的构建 | 第51-52页 |
| 2.1.6 pRE112-Δvpa1324重组载体的构建 | 第52-53页 |
| 2.2 构建敲除菌vcrD1基因片段的POR2菌的筛选和鉴定 | 第53-56页 |
| 3.VPA1324的表达、纯化和抗血清的制备 | 第56-57页 |
| 3.1 VPA1324的表达 | 第56页 |
| 3.2 VPA1324的纯化 | 第56-57页 |
| 4.LC-MS/MS体外检测VPA1324具有EAL二鸟苷酸磷酸二酯酶活性 | 第57-58页 |
| 5.VPA1324依赖T3SS2分泌至真核细胞 | 第58-60页 |
| 5.1 VPA1324是分泌蛋白 | 第58-59页 |
| 5.2 VPA1324依赖T3SS2注入真核细胞 | 第59-60页 |
| 6.VPA1324对宿主细胞的调控作用 | 第60-63页 |
| 6.1 细胞转染重组质粒后的荧光表达情况 | 第60-61页 |
| 6.2 Real-TimeqPCR检测VPA1324对宿主细胞中IRF3水平影响 | 第61-63页 |
| 6.2.1 Real-TimeqPCR检测VPA1324对HeLa细胞中IRF3水平影响 | 第61-62页 |
| 6.2.2 Real-TimeqPCR检测VPA1324对Caco-2细胞中IRF3水平影响 | 第62-63页 |
| 第五章 讨论与展望 | 第63-66页 |
| 参考文献 | 第66-72页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第72-73页 |
| 致谢 | 第73页 |
