| 摘要 | 第2-4页 |
| ABSTRACT | 第4-5页 |
| 缩略语与符号语说明 | 第9-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-18页 |
| 1.1 单核细胞增生李斯特菌概述 | 第10页 |
| 1.2 Lm的主要毒力因子及其致病机理 | 第10-12页 |
| 1.3 Lm-p60蛋白是一种由Lm分泌的胞外蛋白 | 第12页 |
| 1.4 Lm-p60蛋白具有水解肽聚糖的活性 | 第12-14页 |
| 1.5 Lm-p60蛋白的结构域 | 第14-16页 |
| 1.5.1 LysM结构域 | 第14-15页 |
| 1.5.2 SH3结构域 | 第15-16页 |
| 1.5.3 NlpC/P60家族结构域 | 第16页 |
| 1.6 研究意义 | 第16-18页 |
| 第二章 材料与方法 | 第18-31页 |
| 2.1 实验材料 | 第18-20页 |
| 2.1.1 菌株、质粒与引物 | 第18页 |
| 2.1.2 试剂与材料 | 第18-19页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第19-20页 |
| 2.2 溶液配制 | 第20-21页 |
| 2.3 实验方法 | 第21-31页 |
| 2.3.1 以pET30a为载体表达全长Lm-p60蛋白的重组质粒的构建 | 第21-24页 |
| 2.3.1.1 扩增模板的制备 | 第21页 |
| 2.3.1.2 PCR扩增目的基因片段 | 第21页 |
| 2.3.1.3 PCR产物回收 | 第21-22页 |
| 2.3.1.4 目的基因片段与表达载体的酶切 | 第22页 |
| 2.3.1.5 目的基因片段与表达载体的连接 | 第22页 |
| 2.3.1.6 大肠杆菌DH5α与BL21(DE3)感受态细胞制备 | 第22-23页 |
| 2.3.1.7 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 | 第23页 |
| 2.3.1.8 细菌培养 | 第23页 |
| 2.3.1.9 质粒抽提 | 第23-24页 |
| 2.3.1.10 酶切筛选阳性克隆及测序鉴定 | 第24页 |
| 2.3.2 以pET32a为载体表达全长Lm-p60蛋白的重组质粒的构建 | 第24页 |
| 2.3.3 以pET30a为载体表达Lm-p60蛋白N端结构域蛋白的重组质粒的构建 | 第24页 |
| 2.3.4 以pET30a为载体表达Lm-p60蛋白LysM2-C端结构域蛋白的重组质粒的构建 | 第24-25页 |
| 2.3.5 异源表达Lm-p60蛋白最佳原核表达载体的确定 | 第25-26页 |
| 2.3.5.1 各重组蛋白的表达 | 第25页 |
| 2.3.5.2 表达蛋白样品的处理 | 第25页 |
| 2.3.5.3 表达蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳检测和比较分析 | 第25-26页 |
| 2.3.6 以pET30a为载体构建的全长Lm-p60蛋白诱导表达条件的确定 | 第26-27页 |
| 2.3.6.1 含有重组质粒的菌株的培养 | 第26页 |
| 2.3.6.2 Lm-p60蛋白裂解细菌活性的测定 | 第26页 |
| 2.3.6.3 IPTG诱导Lm-p60蛋白表达最佳时机的确定 | 第26页 |
| 2.3.6.4 诱导Lm-p60蛋白表达最适温度的确定 | 第26-27页 |
| 2.3.6.5 诱导Lm-p60蛋白表达最适IPTG浓度的确定 | 第27页 |
| 2.3.6.6 诱导Lm-p60蛋白表达最佳诱导时间的确定 | 第27页 |
| 2.3.6.7 诱导Lm-p60蛋白表达最适摇床转速的确定 | 第27页 |
| 2.3.7 大肠杆菌异源表达Lm-p60蛋白最佳超声波破碎提取时间的确定 | 第27-28页 |
| 2.3.8 异源表达Lm-p60蛋白的纯化及回收率计算 | 第28页 |
| 2.3.8.1 目的蛋白镍亲和层析柱纯化 | 第28页 |
| 2.3.8.2 回收率计算 | 第28页 |
| 2.3.9 带有His标签的Lm-p60融合蛋白裂解溶壁微球菌细胞壁活性最适温度的确定 | 第28-29页 |
| 2.3.10 带有His标签的Lm-p60融合蛋白大量表达纯化及平板打孔法测蛋白抗菌效果 | 第29-30页 |
| 2.3.10.1 带有His标签的Lm-p60融合蛋白的大量诱导表达纯化 | 第29页 |
| 2.3.10.1.1 带有his标签的Lm-p60融合蛋白大量诱导表达纯化 | 第29页 |
| 2.3.10.1.2 带有His标签的Lm-p60融合蛋白的透析 | 第29页 |
| 2.3.10.1.3 带有his标签的Lm-p60融合蛋白的超滤浓缩与浓度测定 | 第29页 |
| 2.3.10.2 琼脂打孔法测带有His标签的Lm-p60融合蛋白抗菌效果 | 第29-30页 |
| 2.3.10.2.1 溶壁微球菌悬液制备 | 第29页 |
| 2.3.10.2.2 抑菌琼脂平板制备 | 第29页 |
| 2.3.10.2.3 琼脂打孔法 | 第29-30页 |
| 2.3.10.3 带有His标签的Lm-p60融合蛋白与溶菌酶混合使用抗菌效果的测定 | 第30页 |
| 2.3.11 Lm-p60蛋白N端及LysM2-C端结构域重组蛋白大量表达纯化及抗菌效果的测定 | 第30-31页 |
| 第三章 实验结果 | 第31-46页 |
| 3.1 重组表达质粒的构建与鉴定 | 第31-32页 |
| 3.2 Lm-p60蛋白最适原核表达载体的确定 | 第32页 |
| 3.3 以pET30a为载体构建的Lm-p60蛋白表达条件的优化 | 第32-37页 |
| 3.3.1 诱导剂IPTG加入时机对Lm-p60蛋白表达量及活性的影响 | 第33页 |
| 3.3.2 诱导温度对Lm-p60蛋白表达量及活性的影响 | 第33-34页 |
| 3.3.3 IPTG浓度对Lm-p60蛋白表达量及活性的影响 | 第34-35页 |
| 3.3.4 诱导时间对Lm-p60蛋白表达量及活性的影响 | 第35-36页 |
| 3.3.5 诱导时摇床转速对Lm-p60蛋白表达量及活性的影响 | 第36-37页 |
| 3.4 超声波破碎时间对大肠杆菌异源表达Lm-p60蛋白质提取率的影响 | 第37-38页 |
| 3.5 异源表达带有His标签的Lm-p60融合蛋白亲和纯化条件的确定 | 第38-40页 |
| 3.5.1 最佳条件下诱导表达Lm-p60蛋白与镍柱亲和层析纯化 | 第38-39页 |
| 3.5.2 最佳条件下诱导表达Lm-p60蛋白纯化回收率计算 | 第39-40页 |
| 3.6 带有His标签的Lm-p60融合蛋白裂解溶壁微球菌细胞壁活性最适温度的测定 | 第40页 |
| 3.7 带有His标签的Lm-p60融合蛋白的大量表达、纯化和浓缩 | 第40-41页 |
| 3.8 琼脂打孔法测带有His标签的Lm-p60融合蛋白的抗菌效果 | 第41-42页 |
| 3.9 琼脂打孔法测带有His标签的Lm-p60融合蛋白与溶菌酶混合使用的抗菌效果 | 第42-43页 |
| 3.10 Lm-p60蛋白的N-端和LysM2-C-端结构域的His-标签融合蛋白的表达和纯化 | 第43-44页 |
| 3.11 Lm-p60蛋白的N-端和LysM2-C端结构域的His-标签融合蛋白的裂解细菌细胞壁活性和抗菌效果 | 第44-46页 |
| 第四章 讨论 | 第46-49页 |
| 参考文献 | 第49-57页 |
| 致谢 | 第57-58页 |
