| 课题资助 | 第4-5页 |
| 符号说明 | 第5-10页 |
| 中文摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 1 前言 | 第15-26页 |
| 1.1 转基因植物的研究进展 | 第15-20页 |
| 1.1.1 转基因植物的发展概况 | 第15-16页 |
| 1.1.2 我国转基因植物发展概况 | 第16页 |
| 1.1.3 选择标记基因的安全性问题 | 第16-17页 |
| 1.1.4 转基因生物及其产品的标识管理制度 | 第17-18页 |
| 1.1.5 NPTⅡ基因及转基因抗虫棉的研究进展 | 第18-20页 |
| 1.2 转基因植物及其产品的检测策略 | 第20-21页 |
| 1.2.1 外源基因 DNA 整合水平检测 | 第20页 |
| 1.2.2 外源基因 RNA 转录水平检测 | 第20页 |
| 1.2.3 外源基因表达水平检测 | 第20-21页 |
| 1.3 转基因植物及其产品的检测方法 | 第21-24页 |
| 1.3.1 核酸水平上的检测 | 第22-23页 |
| 1.3.2 蛋白质的检测 | 第23页 |
| 1.3.3 特定性状或产品的检测 | 第23-24页 |
| 1.4 本课题的研究内容和技术路线 | 第24-26页 |
| 1.4.1 研究内容 | 第24-25页 |
| 1.4.2 技术路线 | 第25-26页 |
| 2 材料和方法 | 第26-48页 |
| 2.1 材料 | 第26-29页 |
| 2.1.1 供试材料 | 第26页 |
| 2.1.2 所需试剂及主要溶液配制 | 第26-28页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第28-29页 |
| 2.2 重组 NPTII 蛋白的原核表达 | 第29-37页 |
| 2.2.1 扩增 NPTII 基因和构建原核表达载体 | 第29-34页 |
| 2.2.1.1 引物设计 | 第29页 |
| 2.2.1.2 回收纯化 DNA | 第29-30页 |
| 2.2.1.3 大肠杆菌 TOP10 感受态细胞的制备 | 第30页 |
| 2.2.1.4 链接转化 | 第30-31页 |
| 2.2.1.5 质粒提取 | 第31-32页 |
| 2.2.1.6 双酶切检测 | 第32-33页 |
| 2.2.1.7 表达载体构建 | 第33-34页 |
| 2.2.2 重组质粒的诱导表达与条件确定 | 第34-35页 |
| 2.2.3 重组 NPTII 蛋白的纯化和含量测定 | 第35-36页 |
| 2.2.4 重组 NPTII 蛋白的 Western-blot 鉴定 | 第36-37页 |
| 2.3 抗 NPTII 蛋白抗体的制备 | 第37-44页 |
| 2.3.1 BABL/c 小鼠的免疫 | 第37-38页 |
| 2.3.2 间接 ELISA 检测小鼠血清抗体效价 | 第38页 |
| 2.3.3 细胞融合 | 第38-40页 |
| 2.3.4 阳性杂交瘤细胞的选择 | 第40页 |
| 2.3.5 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 | 第40-42页 |
| 2.3.6 单克隆抗体抗原识别位点的鉴定 | 第42页 |
| 2.3.7 单克隆抗体亚类鉴定 | 第42页 |
| 2.3.8 单克隆抗体的 Western-blot 鉴定 | 第42-43页 |
| 2.3.9 杂交瘤细胞稳定性检测 | 第43页 |
| 2.3.10 腹水的制备 | 第43页 |
| 2.3.11 新西兰大耳白兔的免疫 | 第43页 |
| 2.3.12 兔血清的分离 | 第43-44页 |
| 2.3.13 兔多克隆抗体的 WESTERN-BLOT 鉴定 | 第44页 |
| 2.4 双抗体夹心 ELISA 检测方法的建立 | 第44-47页 |
| 2.4.1 腹水及兔血清的纯化与抗体效价测定 | 第44-45页 |
| 2.4.2 配对抗体的选择 | 第45页 |
| 2.4.3 捕获抗体和检测抗体最佳配对浓度确定 | 第45-46页 |
| 2.4.4 抗原的包被时间和检测抗体孵育时间的确定 | 第46页 |
| 2.4.5 封闭液的选择 | 第46页 |
| 2.4.6 标准曲线的建立 | 第46页 |
| 2.4.7 双抗体夹心 ELISA 方法的方法学考核 | 第46-47页 |
| 2.5 NPTⅡ基因在棉株不同部位上表达的差异性 | 第47-48页 |
| 2.5.1 植物组织蛋白的提取 | 第47页 |
| 2.5.2 夹心 ELISA 方法的检测 | 第47-48页 |
| 3 结果和分析 | 第48-60页 |
| 3.1 重组 NPTII 蛋白的制备 | 第48-51页 |
| 3.1.1 nptⅡ基因的扩增与测序结果 | 第48页 |
| 3.1.2 构建 PET-28A- NPTⅡ的原核表达质粒 | 第48-49页 |
| 3.1.3 重组质粒的诱导表达与条件确定 | 第49-50页 |
| 3.1.4 重组 NPTII 蛋白的纯化 | 第50-51页 |
| 3.1.5 重组 NPTII 蛋白的 Western-blot 鉴定 | 第51页 |
| 3.2 抗 NPTII 蛋白抗体的制备 | 第51-54页 |
| 3.2.1 BABL/c 小鼠的血清效价检测结果 | 第51页 |
| 3.2.2 细胞融合结果 | 第51-52页 |
| 3.2.3 杂交瘤细胞的亚隆化结果 | 第52页 |
| 3.2.4 单克隆抗体抗原识别位点的鉴定 | 第52页 |
| 3.2.5 单克隆抗体的亚类鉴定结果 | 第52-53页 |
| 3.2.6 杂交瘤细胞系分泌稳定性检测结果 | 第53页 |
| 3.2.7 新西兰大耳白兔的血清效价检测结果 | 第53页 |
| 3.2.8 单克隆抗体和多克隆抗体 Western-blot 鉴定 | 第53-54页 |
| 3.3 双抗体夹心 ELISA 方法的建立 | 第54-58页 |
| 3.3.1 单克隆抗体的纯化和效价测定 | 第54-55页 |
| 3.3.2 包被抗体和检测抗体最佳配对的选择 | 第55页 |
| 3.3.3 最佳配对浓度确定 | 第55-56页 |
| 3.3.4 抗原反应时间和检测单抗反应时间的选择 | 第56页 |
| 3.3.5 封闭液的选择 | 第56页 |
| 3.3.6 标准曲线的建立 | 第56-57页 |
| 3.3.7 双抗体夹心 ELISA 的方法学考核 | 第57-58页 |
| 3.4 NPTⅡ基因在棉株不同部位上的差异表达 | 第58-60页 |
| 4 讨论 | 第60-62页 |
| 4.1 转基因植物中抗生素标记基因检测的必要性 | 第60页 |
| 4.2 转基因植物中抗生素标记基因发展趋势 | 第60-61页 |
| 4.3 制备单克隆抗体的注意事项 | 第61页 |
| 4.4 NPTII 蛋白双抗体夹心 ELISA 方法的优势 | 第61-62页 |
| 5 结论 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
| 攻读学位期间发表论文及研究成果 | 第72页 |
