| 摘要 | 第7-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 缩略语表 | 第10-11页 |
| 1 前言 | 第11-24页 |
| 1.1 自然界中的锰分布与存在状态 | 第11页 |
| 1.2 不同形态的锰的重要作用 | 第11-12页 |
| 1.2.1 锰元素的生物学作用 | 第11-12页 |
| 1.2.2 锰地球化学作用 | 第12页 |
| 1.3 自然界中锰的微生物氧化 | 第12-15页 |
| 1.4 锰的微生物氧化机制 | 第15-19页 |
| 1.5 氧气在细菌锰氧化过程中的重要作用 | 第19页 |
| 1.6 透明颤菌血红蛋白概述 | 第19-23页 |
| 1.6.1 透明颤菌血红蛋白的结构和特性 | 第20-21页 |
| 1.6.2 透明颤菌血红蛋白的细胞定位和生物功能 | 第21页 |
| 1.6.3 透明颤菌血红蛋白的应用 | 第21-23页 |
| 1.7 本研究的目的与意义 | 第23-24页 |
| 2 材料与方法 | 第24-32页 |
| 2.1 主要仪器与试剂 | 第24页 |
| 2.2 培养基 | 第24页 |
| 2.3 锰氧化细菌的筛选和鉴定方法 | 第24-27页 |
| 2.3.1 锰氧化细菌的初筛 | 第24-25页 |
| 2.3.2 具有锰氧化活性菌株的摇瓶复筛 | 第25页 |
| 2.3.3 锰氧化细菌的鉴定 | 第25-26页 |
| 2.3.4 锰氧化菌氧化活性检测方法 | 第26页 |
| 2.3.5 芽胞的提取及其氧化活性检测方法 | 第26-27页 |
| 2.4 分子克隆方法 | 第27-32页 |
| 2.4.1 细菌总DNA提取 | 第27页 |
| 2.4.2 细菌质粒抽提 | 第27页 |
| 2.4.3 目的片段的PCR扩增 | 第27页 |
| 2.4.4 PCR清洁纯化以及切胶回收 | 第27页 |
| 2.4.5 酶切 | 第27页 |
| 2.4.6 连接反应 | 第27页 |
| 2.4.7 转化感受态细胞 | 第27-28页 |
| 2.4.8 序列测定与比对 | 第28页 |
| 2.4.9 载体构建 | 第28-29页 |
| 2.4.9.1 大肠杆菌表达载体的构建 | 第28页 |
| 2.4.9.2 芽胞杆菌表达载体的构建 | 第28-29页 |
| 2.4.9.3 基因中断载体的构建 | 第29页 |
| 2.4.10 蛋白纯化及活性检测 | 第29-30页 |
| 2.4.10.1 重组蛋白的表达及纯化 | 第29-30页 |
| 2.4.10.2 重组蛋白的锰氧化活性的检测 | 第30页 |
| 2.4.11 基因中断突变菌株的筛选 | 第30-31页 |
| 2.4.12 制备一氧化碳 | 第31页 |
| 2.4.13 CO差光光谱分析 | 第31页 |
| 2.4.14 限氧条件下菌体摇瓶生长与锰氧化情况考察 | 第31-32页 |
| 3 结果与分析 | 第32-52页 |
| 3.1 锰氧化细菌的分离与筛选 | 第32-34页 |
| 3.1.1 锰氧化细菌的分离与筛选 | 第32-33页 |
| 3.1.2 分离的锰氧化细菌的16SrDNA的鉴定 | 第33-34页 |
| 3.1.2.1 16SrDNA的PCR扩增 | 第33页 |
| 3.1.2.2 16SrDNA测序与鉴定 | 第33页 |
| 3.1.2.3 分离菌株与已知海洋锰氧化芽胞杆菌的16SrDNA系统发育树 | 第33-34页 |
| 3.2 锰氧化细菌芽胞对Mn(Ⅱ)的氧化 | 第34-35页 |
| 3.2.1 细菌芽胞的提取纯度 | 第34-35页 |
| 3.2.2 纯化的芽胞对Mn(Ⅱ)的氧化 | 第35页 |
| 3.3 锰氧化细菌发酵液上清对Mn(Ⅱ)的氧化 | 第35-37页 |
| 3.3.1 高温处理后上清液对Mn(Ⅱ)的氧化 | 第35-36页 |
| 3.3.2 抑制剂处理后上清液对Mn(Ⅱ)的氧化 | 第36-37页 |
| 3.3.3 上清液中Mn(Ⅱ)氧化因子的分子量研究 | 第37页 |
| 3.4 锰氧化细菌中多铜氧化酶基因的研究 | 第37-52页 |
| 3.4.1 多铜氧化酶基因的扩增 | 第37-40页 |
| 3.4.1.1 简并引物对多铜氧化酶基因的扩增 | 第37-38页 |
| 3.4.1.2 特异性引物对多铜氧化酶基因的扩增 | 第38-40页 |
| 3.4.2 多铜氧化酶基因的克隆表达 | 第40-42页 |
| 3.4.2.1 多铜氧化酶基因的表达载体构建 | 第40-41页 |
| 3.4.2.2 多铜氧化酶基因的表达及纯化 | 第41-42页 |
| 3.4.3 重组蛋白MCOW的体外活性和理化性质 | 第42-45页 |
| 3.4.3.1 重组蛋白MCOW的体外活性 | 第42-43页 |
| 3.4.3.2 重组蛋白MCOW的最适pH值和最适温度 | 第43-44页 |
| 3.4.3.3 金属离子对重组蛋白MCOW活性的影响 | 第44-45页 |
| 3.4.4 锰氧化基因在芽胞杆菌中的表达 | 第45-48页 |
| 3.4.4.1 pHT1K-Plip-TS的启动子修饰 | 第45-46页 |
| 3.4.4.2 多铜氧化酶基因的表达载体构建 | 第46-47页 |
| 3.4.4.3 多铜氧化酶基因的表达及重组菌锰氧化活性检测 | 第47-48页 |
| 3.4.5 多铜氧化酶基因的中断 | 第48-50页 |
| 3.4.5.1 中断载体构建 | 第48-49页 |
| 3.4.5.2 Bacillus sp.WH4中断菌株的构建 | 第49-50页 |
| 3.4.6 VHb在芽胞杆菌中的表达 | 第50-51页 |
| 3.4.7 VHb对芽胞杆菌生长情况的影响 | 第51-52页 |
| 3.4.8 VHb对芽胞杆菌中的锰氧化的影响 | 第52页 |
| 4 讨论 | 第52-57页 |
| 4.1 自然界中锰氧化细菌的分布 | 第52-53页 |
| 4.2 锰氧化活性物质 | 第53-54页 |
| 4.3 多铜氧化酶 | 第54-56页 |
| 4.4 透明颤菌血红蛋白 | 第56-57页 |
| 5 总结与展望 | 第57-59页 |
| 5.1 结论 | 第57-58页 |
| 5.2 展望 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-66页 |
| 致谢 | 第66页 |
