| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 前言 | 第13-30页 |
| 1 血栓类疾病的概述 | 第13-18页 |
| 1.1 血栓类疾病的危害 | 第13-14页 |
| 1.2 血栓的类型 | 第14页 |
| 1.3 血栓形成的机理 | 第14-17页 |
| 1.4 溶栓药物的现状 | 第17-18页 |
| 2 天然溶栓剂 | 第18-19页 |
| 3 体外异源表达系统 | 第19-22页 |
| 3.1 大肠杆菌表达系统 | 第20-21页 |
| 3.2 酵母表达系统 | 第21-22页 |
| 4 毒性蛋白的克隆表达 | 第22-25页 |
| 5 包涵体复性的相关研究 | 第25-28页 |
| 5.1 包涵体的形成 | 第25页 |
| 5.2 包涵体蛋白的复性机制 | 第25-27页 |
| 5.3 包涵体的处理方法 | 第27页 |
| 5.4 包涵体蛋白的复性方法 | 第27-28页 |
| 5.5 小结 | 第28页 |
| 6 立题依据与研究意义 | 第28-30页 |
| 第一章 单环刺螠纤溶酶的重组表达 | 第30-65页 |
| 第一节 真核表达系统的构建 | 第30-47页 |
| 1 pINA-1317-ufeⅡ和pINA-1317-ufeⅢ表达系统的构建 | 第30-39页 |
| 1.1 材料、试剂 | 第30-32页 |
| 1.1.1 载体和菌株 | 第30页 |
| 1.1.2 培养基配制 | 第30-31页 |
| 1.1.3 试剂配制 | 第31-32页 |
| 1.2 表达载体的构建 | 第32-36页 |
| 1.2.1 设计引物及PCR | 第32-34页 |
| 1.2.2 PCR产物的回收及连接转化 | 第34-36页 |
| 1.3 转化到Y.lipolytica Polh感受态中 | 第36页 |
| 1.3.1 制备Y.lipolytica Polh感受态细胞的方法 | 第36页 |
| 1.3.2 转化 | 第36页 |
| 1.4 表达产物活性的鉴定 | 第36-37页 |
| 1.5 结果与讨论 | 第37-39页 |
| 1.5.1 pINA-1317-ufeⅡ和pINA-1317-ufeⅢ表达载体的构建 | 第37-39页 |
| 1.5.2 表达活性测定 | 第39页 |
| 2 pPICZαA-ufeⅡ表达系统的构建 | 第39-47页 |
| 2.1 实验材料 | 第39-41页 |
| 2.1.1 载体与菌株 | 第39页 |
| 2.1.2 培养基配制 | 第39-41页 |
| 2.1.3 试剂 | 第41页 |
| 2.2 实验方法 | 第41-45页 |
| 2.2.1 构建表达系统 | 第41-42页 |
| 2.2.2 电转化 | 第42-44页 |
| 2.2.3 X-33-pPICZαA-ufeⅡ的诱导表达 | 第44-45页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第45-47页 |
| 2.3.1 pPICZαA-ufeⅡ的表达载体的构建 | 第45-46页 |
| 2.3.2 酶活测定 | 第46-47页 |
| 第二节 UFE的大肠杆菌表达系统构建 | 第47-64页 |
| 1 pET32a-ufeⅡ重组质粒的表达 | 第47-55页 |
| 1.1 实验材料 | 第47-49页 |
| 1.1.1 载体与菌株 | 第47页 |
| 1.1.2 试剂 | 第47-49页 |
| 1.2 实验方法 | 第49-52页 |
| 1.2.1 构建pET32a-ufeⅡ的表达系统 | 第49-50页 |
| 1.2.2 pET32a-ufeⅡ的诱导表达 | 第50页 |
| 1.2.3 包涵体蛋白的复性和纯化 | 第50-51页 |
| 1.2.4 SDS-PAGE检测 | 第51页 |
| 1.2.5 复性蛋白的活性检测 | 第51-52页 |
| 1.3 结果与讨论 | 第52-55页 |
| 1.3.1 构建的pET32a-ufeⅡ表达系统 | 第52-53页 |
| 1.3.2 SDS-PAGE检测 | 第53-54页 |
| 1.3.3 活性的检测 | 第54-55页 |
| 2 pMCSG9-ufeⅡ重组质粒的表达 | 第55-57页 |
| 2.1 实验材料 | 第55页 |
| 2.1.1 载体和菌株 | 第55页 |
| 2.2 实验方法 | 第55-56页 |
| 2.2.1 构建pMCSG9-ufeⅡ的表达系统 | 第55页 |
| 2.2.2 pMCSG9-ufeⅡ的诱导表达 | 第55页 |
| 2.2.3 目的蛋白的纯化及活性检测 | 第55-56页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第56-57页 |
| 2.3.1 构建pMCSG9-ufeⅡ的表达系统 | 第56页 |
| 2.3.2 目的蛋白的纯化 | 第56-57页 |
| 3 pET32a-ufeⅢ重组质粒的表达 | 第57-61页 |
| 3.1 实验材料 | 第57页 |
| 3.2 实验方法 | 第57-59页 |
| 3.2.1 构建pET32a-ufeⅢ表达系统 | 第57-58页 |
| 3.2.2 pET32a-ufeⅢ重组质粒诱导表达 | 第58页 |
| 3.2.3 包涵体复性和纯化 | 第58-59页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第59-61页 |
| 3.3.1 表达条件优化 | 第59-60页 |
| 3.3.2 包涵体复性 | 第60-61页 |
| 4 蛋白表达条件优化实验 | 第61-64页 |
| 4.1 实验方法 | 第61-62页 |
| 4.1.1 菌株筛选 | 第61-62页 |
| 4.1.2 自动诱导培养基 | 第62页 |
| 4.1.3 葡萄糖浓度优化 | 第62页 |
| 4.2 实验结果 | 第62-64页 |
| 4.2.1 菌株筛选 | 第62-63页 |
| 4.2.2 自动诱导培养基 | 第63页 |
| 4.2.3 葡萄糖浓度优化 | 第63-64页 |
| 讨论 | 第64-65页 |
| 第二章 UFEⅡ体外活性研究 | 第65-75页 |
| 1. 引言 | 第65页 |
| 2. 材料和试剂 | 第65-66页 |
| 2.1 主要试剂 | 第65页 |
| 2.2 试剂配制 | 第65-66页 |
| 3 方法 | 第66-68页 |
| 3.1 纤维蛋白原平板实验 | 第66-67页 |
| 3.2 纤维蛋白原的降解反应 | 第67页 |
| 3.3 酰胺基降解实验 | 第67-68页 |
| 3.4 Bradford法测蛋白质浓度 | 第68页 |
| 4. 结果 | 第68-73页 |
| 4.1 肽指纹图谱(PMF)进行重组蛋白鉴定 | 第68-69页 |
| 4.2 纤维蛋白(原)平板实验 | 第69-71页 |
| 4.3 纤维蛋白原的降解反应 | 第71-72页 |
| 4.4 酰胺基降解实验 | 第72-73页 |
| 讨论 | 第73-75页 |
| 总结 | 第75-77页 |
| 参考文献 | 第77-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 个人简历 | 第85页 |
