| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9页 |
| 第一章 绪论 | 第10-28页 |
| 1.1 纤维素酶的性质、结构、功能及用途 | 第10-17页 |
| 1.1.1 纤维素及纤维素酶 | 第10-11页 |
| 1.1.2 纤维素酶的研究历程 | 第11-12页 |
| 1.1.3 纤维素酶的性质及纤维素酶的降解机制 | 第12-13页 |
| 1.1.4 纤维素酶的分子结构与功能 | 第13-15页 |
| 1.1.5 纤维素酶的合成调控 | 第15-16页 |
| 1.1.6 纤维素酶的应用 | 第16-17页 |
| 1.2 巴斯德毕赤酵母(P.PASTORIS)表达系统 | 第17-22页 |
| 1.2.1 P.pastoris的生物学特点 | 第17-18页 |
| 1.2.2 P.pastoris表达系统的构成 | 第18-20页 |
| 1.2.3 P.pastoris表达系统的优势 | 第20页 |
| 1.2.4 影响外源蛋白在P.pastoris表达系统中表达的因素 | 第20-22页 |
| 1.3 毕赤酵母表达的蛋白质和瑞氏木霉分泌的CBHI的糖基化 | 第22-26页 |
| 1.3.1 毕赤酵母表达的蛋白质的糖基化 | 第22-26页 |
| 1.3.1.1 糖基化对重组蛋白质产量、功能的影响 | 第23-25页 |
| 1.3.1.2 影响糖基化的可能因素及避免过度糖基化的方法 | 第25-26页 |
| 1.3.2 瑞氏木霉中CBHI的糖基化 | 第26页 |
| 1.4 本研究目的和意义 | 第26-28页 |
| 第二章 外切纤维素酶CBHI的糖基化位点改造及其在毕赤酵母中的表达 | 第28-69页 |
| 2.1 外切纤维素酶CBHI的糖基化位点改造 | 第28-69页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第28-32页 |
| 2.1.1.1 菌株和质粒 | 第28-29页 |
| 2.1.1.2 分子克隆用酶和试剂 | 第29页 |
| 2.1.1.3 培养基和溶液 | 第29-32页 |
| 2.1.2 实验方法 | 第32-47页 |
| 2.1.2.1 菌种的活化培养 | 第32页 |
| 2.1.2.2 pUCmT-cbh1质粒的提取 | 第32页 |
| 2.1.2.3 点突变引物的设计 | 第32页 |
| 2.1.2.4 点突变方法 | 第32-36页 |
| 2.1.2.5 pUCmT-cbh1及其突变体质粒的提取 | 第36-37页 |
| 2.1.2.6 目的基因cbh1及其突变体N45S／N64S／N270S／N384S的PCR扩增 | 第37-38页 |
| 2.1.2.7 重组质粒pPICZα A-cbh1及pPIC9K-cbh1的构建 | 第38-39页 |
| 2.1.2.8 连接液的乙醇沉淀 | 第39-40页 |
| 2.1.2.9 大肠杆菌电转化 | 第40-41页 |
| 2.1.2.10 大肠杆菌转化子的验证 | 第41页 |
| 2.1.2.11 重组质粒与毕赤酵母基因组的同源整合 | 第41-43页 |
| 2.1.2.12 外源蛋白在毕赤酵母中的表达与检测 | 第43-44页 |
| 2.1.2.13 酶活性测定 | 第44-45页 |
| 2.1.2.14 带有His—Tag标签的融合蛋白的纯化 | 第45-47页 |
| 2.1.3 实验结果 | 第47-69页 |
| 2.1.3.1 pUCmT-cbh1质粒 | 第47页 |
| 2.1.3.2 点突变引物设计 | 第47-48页 |
| 2.1.3.3 点突变得到的转化子酶切及测序验证 | 第48-55页 |
| 2.1.3.4 CBHI在毕赤酵母中表达——pPICZαA为载体质粒 | 第55-63页 |
| 2.1.3.5 CBHI在毕赤酵母中表达——pPIC9κ为载体质粒 | 第63-69页 |
| 第三章 毕赤酵母中表达的外切纤维素酶CBHI及其突变体的分离纯化 | 第69-75页 |
| 3.1 导言 | 第69页 |
| 3.2 实验材料 | 第69-70页 |
| 3.3 实验方法 | 第70-71页 |
| 3.3.1 菌种的培养 | 第70页 |
| 3.3.2 粗酶液的制备 | 第70页 |
| 3.3.3 超滤浓缩 | 第70页 |
| 3.3.4 离子交换层析 | 第70-71页 |
| 3.3.5 各收集组分SDS-PAGE检测及酶活测定 | 第71页 |
| 3.4 实验结果 | 第71-75页 |
| 3.4.1 生长曲线 | 第71页 |
| 3.4.2 粗酶液浓缩 | 第71页 |
| 3.4.3 离子交换层析 | 第71-73页 |
| 3.4.4 CBHI酶活测定 | 第73-75页 |
| 第四章 讨论 | 第75-78页 |
| 参考文献 | 第78-82页 |
| 致谢 | 第82-83页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第83页 |
