| 中文摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 缩略语 | 第7-9页 |
| 目录 | 第9-14页 |
| 第1章 前言 | 第14-30页 |
| 1.1 血栓与溶栓药物 | 第14-19页 |
| 1.1.1 血栓的形成及危害 | 第14页 |
| 1.1.2 溶栓药物的研究历史 | 第14-16页 |
| 1.1.3 溶栓药物的主要来源 | 第16-18页 |
| 1.1.4 地鳖虫溶栓作用的研究 | 第18-19页 |
| 1.2 抗肿瘤及抗肿瘤血管生成的研究 | 第19-22页 |
| 1.2.1 血管生成与肿瘤血管生成 | 第19-20页 |
| 1.2.2 肿瘤血管生成的调控因子 | 第20-21页 |
| 1.2.3 中药抗肿瘤血管生成的研究 | 第21-22页 |
| 1.3 大肠杆菌表达系统 | 第22-24页 |
| 1.3.1 宿主细胞 | 第22-23页 |
| 1.3.2 表达载体 | 第23-24页 |
| 1.3.3 影响外源蛋白表达的因素 | 第24页 |
| 1.4 巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第24-28页 |
| 1.4.1 巴斯德毕赤酵母的生物学特性 | 第25页 |
| 1.4.2 毕赤酵母表达载体的类型 | 第25-26页 |
| 1.4.3 质粒在毕赤酵母中的整合 | 第26页 |
| 1.4.4 影响外源基因在毕赤酵母中表达的因素 | 第26-28页 |
| 1.5 本文研究的主要内容及意义 | 第28-30页 |
| 第2章 地鳖虫纤溶活性蛋白抗血栓的研究 | 第30-35页 |
| 2.1 实验材料 | 第30页 |
| 2.1.1 实验动物 | 第30页 |
| 2.1.2 试剂 | 第30页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第30页 |
| 2.2 实验方法 | 第30-32页 |
| 2.2.1 地鳖虫纤溶活性蛋白的制备及纤溶活性测定方法 | 第30-31页 |
| 2.2.2 地鳖虫纤溶活性蛋白对小鼠KPTT、TT、PT、t-PA和PAI的影响 | 第31页 |
| 2.2.3 地鳖虫纤溶活性蛋白对角叉菜胶致小鼠尾部血栓形成的影响 | 第31页 |
| 2.2.4 数据处理 | 第31-32页 |
| 2.3 结果 | 第32-33页 |
| 2.3.1 地鳖虫纤溶活性蛋白对小鼠KPTT、TT和PT的影响 | 第32-33页 |
| 2.3.2 地鳖虫纤溶活性蛋白对小鼠t-PA、PAI活性的影响 | 第33页 |
| 2.3.3 地鳖虫纤溶活性蛋白对角叉菜胶所致小鼠尾部血栓形成的影响 | 第33页 |
| 2.4 讨论 | 第33-35页 |
| 第3章 地鳖虫纤溶活性蛋白抗血管生成及抗肿瘤的研究 | 第35-50页 |
| 3.1 实验材料 | 第35-36页 |
| 3.1.1 实验动物、细胞、瘤株 | 第35页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第35页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第35-36页 |
| 3.2 实验方法 | 第36-40页 |
| 3.2.1 地鳖虫纤溶活性蛋白的提取与纤溶活性测定 | 第36页 |
| 3.2.2 细胞培养 | 第36页 |
| 3.2.3 EFP对人微血管内皮细胞增殖的影响 | 第36-37页 |
| 3.2.4 EFP对人微血管内皮细胞凋亡的作用 | 第37页 |
| 3.2.5 流式细胞仪分析EFP对MVEC细胞周期的影响 | 第37-38页 |
| 3.2.6 EFP对鸡胚尿囊膜(CAM)血管生成的影响 | 第38页 |
| 3.2.7 地鳖虫纤溶活性蛋白对S180和H22荷瘤小鼠的体内抗肿瘤作用 | 第38-40页 |
| 3.2.8 数据处理 | 第40页 |
| 3.3 结果 | 第40-45页 |
| 3.3.1 EFP对人微血管内皮细胞增殖的影响 | 第40-41页 |
| 3.3.2 EFP对人微血管内皮细胞凋亡的作用 | 第41页 |
| 3.3.3 流式细胞仪分析EFP对人微血管内皮细胞周期的影响 | 第41-42页 |
| 3.3.4 EFP对鸡胚尿囊膜(CAM)血管生成的影响 | 第42-43页 |
| 3.3.5 地鳖虫纤溶活性蛋白对S180和H22荷瘤小鼠的体内抗肿瘤作用 | 第43-45页 |
| 3.4 讨论 | 第45-50页 |
| 3.4.1 抗肿瘤血管生成的研究 | 第45-48页 |
| 3.4.2 抗肿瘤的研究 | 第48-50页 |
| 第4章 地鳖虫纤溶活性蛋白基因的cDNA克隆 | 第50-58页 |
| 4.1 实验材料 | 第50-51页 |
| 4.1.1 菌种和载体 | 第50页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第50页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第50页 |
| 4.1.4 引物 | 第50-51页 |
| 4.2 实验方法 | 第51-53页 |
| 4.2.1 地鳖虫总RNA的提取 | 第51页 |
| 4.2.2 地鳖虫纤溶活性蛋白基因cDNA5’端序列的合成 | 第51-52页 |
| 4.2.3 3’RACE 法合成地鳖虫纤溶活性蛋白基因 cDNA 序列的3’端 | 第52-53页 |
| 4.2.4 地鳖虫纤溶活性蛋白基因cDNA的克隆 | 第53页 |
| 4.3 结果 | 第53-57页 |
| 4.3.1 总RNA的提取 | 第53-54页 |
| 4.3.2 PCR扩增合成地鳖虫纤溶活性蛋白基因cDNA5’端序列 | 第54页 |
| 4.3.3 地鳖虫纤溶活性蛋白基因cDNA3’末端的合成 | 第54-55页 |
| 4.3.4 地鳖虫纤溶活性蛋白基因cDNA序列的获得及PCR扩增与序列测序 | 第55-56页 |
| 4.3.5 地鳖虫纤溶活性蛋白基因cDNA的序列分析及氨基酸序列同源性分析 | 第56-57页 |
| 4.4 讨论 | 第57-58页 |
| 第5章 地鳖虫纤溶活性蛋白的大肠杆菌表达 | 第58-71页 |
| 5.1 实验材料 | 第58-59页 |
| 5.1.1 菌株和质粒 | 第58页 |
| 5.1.2 主要试剂 | 第58页 |
| 5.1.3 培养基和溶液 | 第58-59页 |
| 5.1.4 主要仪器和设备 | 第59页 |
| 5.2 实验方法 | 第59-64页 |
| 5.2.1 引物的设计与合成 | 第59页 |
| 5.2.2 PCR扩增 | 第59-60页 |
| 5.2.3 PCR产物的胶回收与纯化 | 第60页 |
| 5.2.4 目的基因克隆至pUCm-T载体 | 第60页 |
| 5.2.5 酶切鉴定 | 第60-61页 |
| 5.2.6 DNA序列测序 | 第61页 |
| 5.2.7 表达载体pET28a和pUCm-T-EFP的制备和酶切 | 第61页 |
| 5.2.8 连接反应 | 第61-62页 |
| 5.2.9 转化大肠杆菌DH5a | 第62页 |
| 5.2.10 重组转化子的鉴定 | 第62页 |
| 5.2.11 重组质粒的测序 | 第62页 |
| 5.2.12 重组质粒转化表达菌株E.coli Rossetta(DE3)plysS | 第62页 |
| 5.2.13 工程菌的诱导表达 | 第62页 |
| 5.2.14 表达蛋白的可溶性分析 | 第62-63页 |
| 5.2.15 Western-blot分析 | 第63页 |
| 5.2.16 工程菌的优化表达 | 第63页 |
| 5.2.17 重组表达蛋白抗血清的制备 | 第63-64页 |
| 5.3 实验结果 | 第64-69页 |
| 5.3.1 地鳖虫纤溶活性蛋白基因的PCR扩增及pUCm-T-EFP载体的构建和酶切鉴定 | 第64-65页 |
| 5.3.2 pET28a-EFP的构建、酶切鉴定和测序 | 第65-66页 |
| 5.3.3 工程菌的诱导表达 | 第66页 |
| 5.3.4 表达蛋白的可溶性分析 | 第66-68页 |
| 5.3.5 表达蛋白的Western-blot分析结果 | 第68-69页 |
| 5.3.6 工程菌的优化表达 | 第69页 |
| 5.3.7 重组表达蛋白抗血清的制备 | 第69页 |
| 5.4 讨论 | 第69-71页 |
| 第6章 地鳖虫纤溶活性蛋白的毕赤酵母表达 | 第71-86页 |
| 6.1 实验材料 | 第71-74页 |
| 6.1.1 菌株和质粒 | 第71页 |
| 6.1.2 主要试剂 | 第71页 |
| 6.1.3 培养基和溶液 | 第71-74页 |
| 6.1.4 主要仪器和设备 | 第74页 |
| 6.2 实验方法 | 第74-79页 |
| 6.2.1 引物的设计与合成 | 第74页 |
| 6.2.2 PCR扩增 | 第74-75页 |
| 6.2.3 PCR产物的胶回收及纯化 | 第75页 |
| 6.2.4 回收产物的双酶切和纯化 | 第75-76页 |
| 6.2.5 质粒载体pPICZa-A的制备和酶切 | 第76页 |
| 6.2.6 连接反应 | 第76页 |
| 6.2.7 转化大肠杆菌DH5a | 第76页 |
| 6.2.8 重组转化子的鉴定 | 第76-77页 |
| 6.2.9 重组质粒的测序 | 第77页 |
| 6.2.10 重组表达质粒导入酵母和阳性转化子的筛选 | 第77-78页 |
| 6.2.11 甲醇利用型的鉴定 | 第78-79页 |
| 6.2.12 转化菌株的诱导表达 | 第79页 |
| 6.2.13 表达蛋白的检测 | 第79页 |
| 6.3 实验结果 | 第79-84页 |
| 6.3.1 重组质粒pPICZaA-EFP的构建和鉴定 | 第79-80页 |
| 6.3.2 pPICZaA-EFP转化毕赤酵母GS115和阳性克隆的鉴定 | 第80-81页 |
| 6.3.3 阳性转化子甲醇利用型的鉴定 | 第81-82页 |
| 6.3.4 重组酵母的诱导表达及SDS-PAGE电泳分析 | 第82-83页 |
| 6.3.5 重组表达蛋白的活性测定 | 第83页 |
| 6.3.6 Western blot分析诱导表达蛋白 | 第83-84页 |
| 6.4 讨论 | 第84-86页 |
| 本文主要结论 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-92页 |
| 附录 | 第92-95页 |
| 个人简历和论文情况 | 第95-96页 |
| 致谢 | 第96页 |
