| 摘要 | 第4-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 第一章 绪论 | 第15-39页 |
| 1.1 嗜热酶 | 第15-16页 |
| 1.1.1 嗜热菌的发现 | 第15页 |
| 1.1.2 嗜热酶及其应用 | 第15-16页 |
| 1.2 嗜热酯酶 | 第16-19页 |
| 1.2.1 酯酶 | 第16页 |
| 1.2.2 嗜热酯酶 | 第16-17页 |
| 1.2.3 嗜热酶APE1547 的结构和催化机制 | 第17-19页 |
| 1.3 酯酶的结构与其底物特异性和活性的相关性研究 | 第19-21页 |
| 1.3.1 活性中心的位置 | 第19-20页 |
| 1.3.2 底物结合口袋和活性中心的静电环境 | 第20页 |
| 1.3.3 底物结合口袋的疏水性 | 第20-21页 |
| 1.3.4 底物结合口袋的体积和形状 | 第21页 |
| 1.4 蛋白质工程方法 | 第21-24页 |
| 1.4.1 理性设计 | 第22页 |
| 1.4.2 非理性设计 | 第22-23页 |
| 1.4.3 半理性设计 | 第23-24页 |
| 1.5 水-有机溶剂互溶体系中的酶学和蛋白质工程进展 | 第24-30页 |
| 1.5.1 溶剂工程 | 第24-25页 |
| 1.5.2 水-有机溶剂互溶体系对酶促水解反应的影响 | 第25-27页 |
| 1.5.3 水-有机溶剂互溶体系对酶构象和稳定性的影响 | 第27-29页 |
| 1.5.4 水-有机溶剂互溶体系对酶活性和底物特异性的影响 | 第29-30页 |
| 1.6 本论文的立论依据和设计思路 | 第30-39页 |
| 第二章 嗜热酯酶催化结构域的定向进化 | 第39-69页 |
| 2.1 序言 | 第39页 |
| 2.2 实验材料 | 第39-40页 |
| 2.2.1 菌种和质粒 | 第39页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第39-40页 |
| 2.2.3 主要仪器 | 第40页 |
| 2.3 实验方法 | 第40-51页 |
| 2.3.1 试剂的配制 | 第40-41页 |
| 2.3.2 软件 | 第41页 |
| 2.3.3 随机突变库的构建和筛选 | 第41-48页 |
| 2.3.4 酶的制备和纯化 | 第48-49页 |
| 2.3.5 蛋白浓度测定 | 第49页 |
| 2.3.6 酶学性质分析 | 第49-50页 |
| 2.3.7 分子动力学分析 | 第50-51页 |
| 2.4 实验结果 | 第51-62页 |
| 2.4.1 随机突变库的构建 | 第51页 |
| 2.4.2 随机突变库的高通量筛选 | 第51-53页 |
| 2.4.3 酶的纯化结果 | 第53-54页 |
| 2.4.4 最适温度变化 | 第54-55页 |
| 2.4.5 T560W 突变对酶的热稳定性影响 | 第55-56页 |
| 2.4.6 突变体E01 的最适pH | 第56-57页 |
| 2.4.7 底物特异性及催化动力学常数的测定 | 第57-58页 |
| 2.4.8 SLITHER 计算T560W 突变对次要通道的影响 | 第58-60页 |
| 2.4.9 分子动力学分析T560 位点的突变对催化三联体的影响 | 第60-62页 |
| 2.5 讨论 | 第62-66页 |
| 2.5.1 随机突变库的筛选与必要库容量 | 第62页 |
| 2.5.2 影响筛选结果的因素及相应对策 | 第62-64页 |
| 2.5.3 远离活性中心的突变对酶的影响 | 第64页 |
| 2.5.4 如何理解Slither 预测的结果--T560W 突变对次要通道的影响 | 第64-66页 |
| 2.6 小结 | 第66-69页 |
| 第三章 对活性中心非保守残基和底物结合口袋的半理性设计 | 第69-97页 |
| 3.1 序言 | 第69页 |
| 3.2 实验材料 | 第69-70页 |
| 3.2.1 菌种和质粒 | 第69页 |
| 3.2.2 主要试剂 | 第69页 |
| 3.2.3 软件 | 第69-70页 |
| 3.2.4 仪器 | 第70页 |
| 3.2.5 溶液配制 | 第70页 |
| 3.3 实验方法 | 第70-74页 |
| 3.3.1 GxSxG 基序的同源序列比对 | 第70页 |
| 3.3.2 底物结合部位残基的确定 | 第70-71页 |
| 3.3.3 对特定位点的结构分析 | 第71页 |
| 3.3.4 饱和突变库的建立 | 第71-72页 |
| 3.3.5 饱和突变库的筛选 | 第72-73页 |
| 3.3.6 酶的纯化 | 第73页 |
| 3.3.7 酶的性质表征 | 第73页 |
| 3.3.8 突变体酶的模建与底物结合口袋分析 | 第73-74页 |
| 3.4 结果 | 第74-89页 |
| 3.4.1 同源序列比对 | 第74-75页 |
| 3.4.2 底物结合部位饱和突变位点的选择 | 第75页 |
| 3.4.3 筛选饱和突变库的结果 | 第75-79页 |
| 3.4.4 复筛结果 | 第79页 |
| 3.4.5 突变体序列测定 | 第79页 |
| 3.4.6 Y444、Y446 和Y449 残基三级结构分析 | 第79-85页 |
| 3.4.7 突变体酶的热稳定性 | 第85-86页 |
| 3.4.8 突变体酶的最适温度 | 第86页 |
| 3.4.9 突变体酶的最适pH | 第86-87页 |
| 3.4.10 突变体活性和底物特异性测定结果 | 第87-88页 |
| 3.4.11 反应动力学常数的测定 | 第88-89页 |
| 3.5 讨论 | 第89-94页 |
| 3.5.1 GxSxG 基序的非保守残基的保守性 | 第89-91页 |
| 3.5.2 HG 基序附近的370 位点对活性的影响及原因分析 | 第91-92页 |
| 3.5.3 底物结合部位残基对酶的底物选择性的影响 | 第92-93页 |
| 3.5.4 F488G、F488P 和W474V 突变对E01 其它性质的影响 | 第93页 |
| 3.5.5 探测“可塑性”残基的意义 | 第93-94页 |
| 3.6 小结 | 第94-97页 |
| 第四章 474、488 位点氨基酸性质对催化活性的影响 | 第97-113页 |
| 4.1 序言 | 第97页 |
| 4.2 实验材料 | 第97页 |
| 4.2.1 菌种和质粒 | 第97页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第97页 |
| 4.2.3 主要仪器 | 第97页 |
| 4.3 实验方法 | 第97-99页 |
| 4.3.1 试剂的配制 | 第97-98页 |
| 4.3.2 软件 | 第98页 |
| 4.3.3 定点突变 | 第98-99页 |
| 4.3.4 突变位点的鉴定 | 第99页 |
| 4.3.5 突变质粒的转化和突变体酶的表达、纯化 | 第99页 |
| 4.3.6 突变体酶的性质表征 | 第99页 |
| 4.4 结果 | 第99-108页 |
| 4.4.1 突变质粒的测序鉴定 | 第99页 |
| 4.4.2 酶的各种催化活性 | 第99-100页 |
| 4.4.3 位点488 和474 对最适pH 的影响 | 第100页 |
| 4.4.4 位点488 和474 对酶最适温度的影响 | 第100-102页 |
| 4.4.5 各突变体酶的催化动力学常数 | 第102-104页 |
| 4.4.6 488 残基对酰基口袋的形状和体积的影响 | 第104-105页 |
| 4.4.7 488 残基对底物对接的影响 | 第105-106页 |
| 4.4.8 474 位点对酰基口袋形状和体积的影响 | 第106页 |
| 4.4.9 474 位点对底物对接的影响 | 第106-107页 |
| 4.4.10 W474V/F488G双突变对底物对接的影响 | 第107-108页 |
| 4.5 讨论 | 第108-110页 |
| 4.5.1 嗜热酶APE1547 从多能型向酯酶专一性的进化 | 第108页 |
| 4.5.2 结构分析和催化动力学分析的结合应用 | 第108-110页 |
| 4.6 小结 | 第110-113页 |
| 第五章 溶剂工程研究 | 第113-126页 |
| 5.1 序言 | 第113页 |
| 5.2 实验材料 | 第113-114页 |
| 5.2.1 菌种和质粒 | 第113页 |
| 5.2.2 主要试剂 | 第113-114页 |
| 5.2.3 主要仪器 | 第114页 |
| 5.3 实验方法 | 第114-115页 |
| 5.3.1 试剂的配制 | 第114页 |
| 5.3.2 软件 | 第114页 |
| 5.3.3 酶的制备与纯化 | 第114页 |
| 5.3.4 极性有机溶剂浓度对突变体底物特异性和活性的影响 | 第114页 |
| 5.3.5 分子动力学模拟 | 第114-115页 |
| 5.4 实验结果 | 第115-125页 |
| 5.4.1 各种低浓度有机溶剂对S01 的影响 | 第115页 |
| 5.4.2 乙腈浓度对不同突变体酶活性的影响 | 第115-117页 |
| 5.4.3 各突变体对乙腈的C_(50) 值 | 第117-118页 |
| 5.4.4 488 位点氨基酸疏水性与乙腈的C_(50) 值的相关性 | 第118页 |
| 5.4.5 有机溶剂对酶活性的影响 | 第118-119页 |
| 5.4.6 有机溶剂对底物特异性的影响 | 第119-123页 |
| 5.4.7 分子动力学模拟结果 | 第123-125页 |
| 5.5 讨论 | 第125-126页 |
| 5.6 小结 | 第126页 |
| 参考文献 | 第126-129页 |
| 论文创新点 | 第129-131页 |
| 研究展望 | 第131-133页 |
| 附录 | 第133-137页 |
| 附录一. APE1547 C 端催化结构域的拓扑结构 | 第133-134页 |
| 附录二. APE1547 的二级结构 | 第134-135页 |
| 附录三 氨基酸的单字母、三字母缩写和英文全称 | 第135-136页 |
| 附录四氨基酸残基的性质 | 第136-137页 |
| 作者简历 | 第137页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 | 第137页 |
| 参与课题? | 第137-138页 |
| 致谢 | 第138页 |
